Candida parapsilosis szekretált aszpartil proteinázok virulenciában betöltött szerepének vizsgálata

Előnézet	PDF (disszertáció) Download (10MB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (280kB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (408kB) | Előnézet

Magyar nyelvű absztrakt

A Candida fajok által kiváltott megbetegedések az elmúlt három évtized során egyre növekvő egészségügyi problémát jelentenek.Bár ezen élesztők többsége a normál, humán mikroflóra része, bizonyos körülmények között a bőrt, nyálkahártyát, vagy az egész szervezetet érintő, szisztémás fertőzés kiváltására képesek. Epidemiológiai vizsgálatok szerint, a felnőtt lakosság körében a kandidiázisos esetek legnagyobb hányadát a C. albicans okozza, azonban újszülöttek körében a kandidiázisos kórképek kialakulásáért felelős ágensek körében a C. parapsilosis sok esetben a C. albicans által kiváltott esetszámot is felülmúlja. Bár az ezredforduló óta a nem-albicans fajok (újszülöttek körében főként a C. parapsilosis) által okozott megbetegedések aránya növekvő tendenciát mutat, azok patomechanizmusáról, virulencia faktorairól kevés ismeret áll rendelkezésünkre. C. parapsilosis által kiváltott fertőzések esetén jelentős szerep jut a mikroba által szekretált hidrolitikus enzimeknek, főként a lipázoknak és szekretált aszpartil proteinázoknak. Szekretált aszpartil proteinázok esetén a C. parapsilosis két fő proteinázának, a Sapp1 és Sapp2 fehérjék enzimológiai tisztítása és jellemzése történt meg,ám azok virulenciában betöltött szerepe eddig nem tisztázott. A mikroorganizmus SAPP3 génjét ezidáig mint putatív szekvenciát tartják számon. Továbbá, bár C. parapsilosis esetén napjainkra számos géndeléciós módszer elérhető, azonban C. albicans-al ellentétben overexpressziós módszer ezen mikroba esetén nem áll rendelkezésre. Munkánk során sikeresen előállítottuk a Candida parapsilosis SAPP génjeire deléciós mutáns törzseket. Vizsgálataink során bebizonyítottuk, hogy a Candida parapsilosis fő szekretált proteinázának, a Sapp1 fehérjének jelentős szerepe van a mikroba szérumban való túlélésében, valamint a fagocitózis gátlásában. Bár ezen fehérjének jelentős szerep jut a mikroba fagocita sejten belüli túlélésében, ám a Sapp negatív törzs vizsgálata rávilágított, hogy az intracelluláris túlélés során jelentős szerep jut a további szekretált aszpartil proteináz fehérjéknek is. Sejtfalösszetétel vizsgálataink rámutattak, hogy a Sapp negatív törzs sejtfalában található kitin tartalom jelentősen lecsökkent, míg a glükán tartalom jelentősen megemelkedett a vad típusútörzshöz képest. Ez az eredmény jól mutatja, hogy a szekretált aszpartil proteinázok nem csak mint virulencia faktorok fontosak, de a mikroba sejtfalintegritásának fenntartásában is jelentős szereppel bírnak. Munkánk során kidolgoztunk továbbá egy C. parapsilosis-ra optimalizált gén overexpressziós rendszert is. Ennek során a C. parapsilosis CLIB 214 leucin auxotróf törszének RP10 régiójába integráltuk a C. albicans RP10 lokuszát. Annak kiderítésére, hogy ezen létrehozott fogadó törzs képes-e működtetni a majdani overexpressziós vektorokat a a Clp10-caTDH3-GFP vektor leucin auxotrófia markert hordozó változatát a létrehozott fogadó törzs C. albicans RP10 régiójába integráltuk. A transzformáns telepek összes sejtje GFP pozitív volt, amely jól demonstrálja, hogy a C. parapsilosis is képes a TDH3 promoter által szabályozott gének működtetésére. Az overexpressziós vektorok rövid időn belüli létrehozásához a gateway klónozási rendszert alkalmaztuk. Az első, gateway klónozással előállított overexpressziós vektorunk a WOR1 gént hordozó pTDH3-GTW-LEU2 destination vektor. A WOR1 gén C. albicans béli ortológjáról kimutatták, hogy a white-opaque átmenetben játszik fontos szerepet. Az elkészített destination vektor C. albicans RP10 régióját hordozó C. parapsilosis törzsbe történő transzformációját követően, a transzformánsok qRT-PCR vizsgála a WOR1 gén expressziójában bekövetkezett mintegy tízszeres overexpressziót mutattak. Ez az eredmény jól mutatja, hogy az alkalmazott rendszer eredményesen használható C. parapsilosis gének túlműködtetésére, ezáltal új utat nyit meg a mikroba génjeinek tanulmányozására. A rendszer előnye, hogy a deléciós módszerekkel összevetve jóval rövidebb idő alatt létrehozhatók az overexpressziós mutáns törzsek, így rövid időn belül nagy számú gén vizsgálata (akár a C. parapsilosis teljes ORF-om) válik lehetségessé.

Tétel nézet