Egy DNS-metiltranszferáz specifitásának megváltoztatása tervezett enzimátalakítással és irányított enzimevolúcióval

	PDF (disszertáció) Download (4MB)
	PDF (tézisfüzet) Download (304kB)

Magyar nyelvű absztrakt

Emlős genomokban a CG dinukleotidokban elhelyezkedő citozinok egy része metilált formában (C5-metilcitozin) van jelen. A CG-metiláció mint epigenetikai jel fontos szerepet játszik többek között a génexpresszió szabályozásában, az embrionális fejlődésben, az X-kromoszóma inaktivációban, valamint az imprinting jelenségében. Feltételezik, hogy az abnormális genomi metiláció hozzájárulhat különféle betegségek (pl. a rák) kialakulásához. A közelmúltban felfedezték, hogy bizonyos sejttípusokban a CA, CT és CC (röviden: CH) dinukleotidokban található citozinok is metilálódhatnak. Ennek a nem-kanonikus metilációnak jelenleg nem ismert a biológiai szerepe. A CG és a CH-metilációért is ugyanazok ez enzimek (Dnmt3a és Dnmt3b) a felelősek. A nem-CG metiláció kutatását nagyban elősegítené, ha elérhetőek lennének olyan enzimek, melyekkel célzottan metilálni lehetne a CH helyeket, anélkül hogy befolyásolnánk a CG-metilációs mintázatot. Jelenleg ilyen specifitású C5-MTázok nem ismertek. Munkánk során célul tűztük ki a bakteriális M.MpeI DNS-metiltranszferáz olyan mutánsainak előállítását, melyek szekvenciaspecifitása CG-ről CH-ra (CA, CT, CC, vagy ezek kombinációja) változott. A projekt első szakaszában arra törekedtünk, hogy a CG specifitást CN-re rontsuk, melyet helyspecifikus mutagenezissel kívántunk elérni. A mutagenizálandó aminosavak kiválasztásánál felhasználtuk az M.MpeI DNS-sel alkotott specifikus komplexének rtg. diffrakciós szerkezetéből nyerhető információt. Elsősorban olyan aminosavakat változtattunk helyspecifikus mutagenezissel, amelyek a felismerőhely nem szubsztrátbázispárjával (5’-CG/5’-CG-3’) létesítenek specifikus kölcsönhatásokat. Létrehoztunk olyan enzimváltozatokat is, amelyekben az aromás oldalláncával a nem-szubsztrát szálban lévő C és G közé ékelődő, jellegzetes torzulást okozó és ezáltal a szekvenciaspecifitásban valószínűleg szerepet játszó 302-es fenilalanint cseréltük más aminosavra. Az elkészült mutánsok között voltak egyszerű aminosavcserék, mikrodeléciók, illetve ezek kombinációi. A mutáns enzimek fenotípusának vizsgálatához a MTáz-változatokat kódoló plazmidokat E. coli sejtekből izoláltuk, majd olyan restrikciós enzimekkel emésztettük, amelyekről tudtuk, hogy működésüket a keresett relaxált specifitású metiláció megakadályozná. A védett fragmentumok megjelenéséből, méretéből következtettünk a mutáns enzimek megváltozott specifitására. A relaxált specifitású M.MpeI változat előállításához a nem-szubsztrát bázispár mindkét tagjának felismerését meg kellett szüntetnünk. A 2. felismerőhurokban található A323 főlánca és a metilálandó citozint követő guanin közötti hidrogénhíd megzavarásának leghatékonyabb módjának az A323 deléciója bizonyult. A megfelelő aktivitású enzim létrehozásához szükség volt az N324G mutáció beépítésére, amely valószínűleg megszüntetett egy, az A323 deléció által okozott, szerkezeti torzulást. A legjobb aktivitással rendelkező relaxált specifitású mutáns (ΔA323 + N324G +E305A) az in vitro mérések alapján a CG helyek mellett a CA és CC dinukleotidokat is elfogadta szubsztrátnak, a CT dinukleotidokat nem metilálta. A munka második szakaszában az volt a célunk, hogy növeljük az enzim CH specifikus aktivitását, lehetőség szerint a kanonikus CG-metilációs aktivitás rovására. Az egyik munka során telítési mutagenezist végeztünk, mely azokat az aminosavakat érintette, melyek feltételezéseink szerint szerepet játszhatnak a nem-szubsztrát szálban elhelyezkedő citozin felismeréséban(CG/CG). A sejtekből izolált plazmidok emésztési képe alapján azonosítottunk egy mutánst (ΔA323+N324G+E305N), amely kissé hatékonyabban metilálta a CC helyeket, mint a ΔA323+N324G+E305A. Sajnos ez a változat továbbra is nagymértékben metilálta a kanonikus CG helyeket is. Egy párhuzamos munka során a ΔA323+N324G+E305A mutánst kódoló gén egy nagyobb szakaszát (~500 bp) random mutagenezisnek vetettük alá. Ennek eredményeként egy megközelítőleg 60 000 klónból álló plazmidkönyvtárat kaptunk. A könyvtárból Eco47I (felismerőhely: GGWCC, a belső és az 5’ végi citozin C5 metilációja véd az emésztéssel szemben) emésztéssel igyekeztünk olyan plazmidokat szelektálni, amely CA és/vagy CC specifitású metiltranszferáz enzimeket kódolnak. Az emésztést túlélt és transzformálással visszanyert plazmidok közül az egyik a ΔA323+N324G+R326G+E305A négyes mutánst kódolta, amely a védési tesztek alapján megnövekedett CC specifikus metiltranszferáz aktivitást mutatott. Az R326G mutációnak további előnyös következménye volt, hogy a CG dinukleotidok metilációja csaknem teljesen megszűnt. A két mutagenezis kísérletből származó előnyös mutációk (E305N és R326G) kombinálásával létrehoztunk egy újabb négyes mutánst (ΔA323+N324G+R326G+E305N), amely továbbra is minimális mértékben metilálta a CG helyeket, a CC specifikus metilációs aktivitás viszont tovább fokozódott. A ΔA323+N324G+R326G+E305N négyes mutáns oldható formában termelődik és nagy mennyiségben tisztítható. Az in vitro mérések alapján az enzim m

Absztrakt (kivonat) idegen nyelven

In most mammalian cells, a fraction of cytosines located in CG dinucleotides are methylated (C5-methylcytosine). CG methylation is an important epigenetic mechanism, which has roles in a wide range of phenomena such as gene silencing, genomic imprinting, embryonic development and X-chromosome inactivation. Dysregulation of CG methylation is the hallmark of several diseases including cancer. Besides the predominant CG context, C5-methylcytosines were also found in non-CG context; i.e. CA, CT, or CC (collectively: CH). The biological role of non-CG methylation is currently unknown. The same C5-MTases are responsible for both CG- and non-CG-methylation in mammals. Analysis of the biological role of non-CG-methylation would be greatly aided by experimental systems, which would allow targeting of C5-methylation to predetermined genomic non-CG sites in vivo. Unfortunately, C5-MTases methylating CA, CC or CT sites are not known to exist. We aimed to create variants of the CG specific bacterial C5-MTase M.MpeI, which can methylate cytosines in CH (CA, CC, CT, or any combination thereof), but not in CG context. We chose M.MpeI, because it has some advantages (higher activity and the availability of an X-ray structure), compared to the mammalian enzymes or to the commercially available CG-specific bacterial MTase M.SssI. The desired CH-specific M.MpeI variant could be a useful research tool in the study of the biological role of non-CG specific DNA methylation in higher eukaryotes. Our first objective was broadening (relaxing) the specificity of M.MpeI from CG to CN. To obtain relaxed specificity variants of M.MpeI, we employed site directed mutagenesis guided by the crystallographic structure of the specific DNA-MTase complex. The primary targets were amino acids contacting the second basepair (E305, A323) of the CG recognition site (5’-CG/5’-CG). A phenylalanine residue (F302), which presumably contributes to indirect sequence readout by inducing a characteristic distortion in the target DNA structure, was also subjected to mutagenesis. Several mutants including amino acid replacements, microdeletions, or combinations thereof were constructed. The phenotypes of the mutant proteins were first analyzed in E. coli using restriction-protection assay: plasmid DNA extracted from cells overexpressing the mutants was digested with restriction endonucleases sensitive to cytosine methylation in specific sequence contexts. Most M.MpeI variants containing single or double amino acid substitutions retained CG specificity with variable levels of catalytic activity. The specificity change was finally brought about by the deletion of A323, which recognizes the guanine of the second basepair in the CG target site (5’-CG/5’-CG) by a main chain hydrogen bond. Unfortunately, the activity of this mutant (ΔA323) was very low. Inspection of the crystal structure suggested that the diminished activity of the ΔA323 variant could be, at least partly, explained by a steric clash between the rather bulky N324 sidechain and the DNA. This observation prompted us to add the N324G substitution to the deletion mutant. As expected, the double mutant ΔA323+N324G retained the relaxed specificity of ΔA323, but displayed significantly higher overall MTase activity. The MTase activity was further improved by combining the ΔA323+N324G mutations with the E305A substitution, which, by itself, had no effect on specificity. The M.MpeI (ΔA323+N324G+E305A) triple mutant was purified and characterized in vitro using [methyl-3H]-labeled S-adenosylmethionine and oligonucleotide duplexes containing single CG, CA, CT, or CC substrate sites. The ΔA323+N324G+E305A mutant methylated CA and CC dinucleotides in addition to the canonical CG, but did not modify CT sites. In the second part of the work we aimed to achieve a further shift in the specificity of the triple mutant towards non-CG sites using random mutagenesis. A single-round directed evolution experiment and a further site directed mutation (E305N) yielded the quadruple mutant M.MpeI(ΔA323+N324G+R326G+E305N), which efficiently methylated CC sites but had very low activity on CG dinucleotides. The mutant had a very strong bias towards CC sites flanked by 3’ A or C making it a CCA/CCC specific MTase which represents a novel MTase specificity.

Tétel nézet