RAD18-dependent Activation of FAN1 by Ub-PCNA to Rescue DNA Interstrand crosslinks along with TLS Pol η

Előnézet	PDF (disszertáció) Download (3MB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (367kB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (383kB) | Előnézet

Magyar nyelvű absztrakt

Tanulmányaink során bebizonyítottuk, hogy a FAN1 fehérjét a Rad18 DNS-hibatolerancia útvonal szabályozza in vivo, és koloklizál az ubiquitilált PCNA-vel. In vitro kísérleti rendszerekkel bemutattuk, hogy a PCNA, illetve az ubiquitilált PCNA fokozza a FAN1 endonukleáz aktivitását. Továbbá bebizonyítottuk, hogy a PIP-box, illetve az UBZ doménjai interkcióba léptnek az ubiquitilált PCNA-vel. Azt is kimutattuk, hogy a FAN1 endonukleáz aktivitásának specificitása megváltozott a PCNA hatására. A PCNA ugyanis képes pozícionálni a FAN1-et, hogy egy adott régióban hasítson (4 nukleotiddal a replikációs villa elágazási pontja után) egy 5’ túlnyúló véget tartalmazó szubsztráton, így elősegítve a DNS-szálak között létrejött keresztkötések javítását. Továbbá összehasonlítottuk három transzléziós polimeráz (pol η, pol ι, and pol κ) működését a DNS-szálak közötti keresztkötéseken. A pol η az egyetlen transzléziós polimeráz, amely képes áthaladni a hibás szakaszon. Sejttúlélési vizsgálatokkal bebizonyítottuk a FAN1 és a pol η episztázisát, és azt, hogy a FAN1 és a pol η funkcionális interakciót mutat cisplatin kezelést követően. Összefoglalásként kijelenthetjük, hogy a jelenlegi eredményeink arra utalnak, hogy a FAN1 nem csak a Fanconi anemia útvonalban játszik szerepet, de részt vesz a RAD18-függő DNS-hibatrolerancia útvonalakban is az elakadt replikációs villa menekítése során. Ezáltal egy új modellt állítottunk fel a működésére: A DNS-szálak között létrejött keresztkötések során az FAN1 nukleáz ubiquitilált PCNA-függő módon kihurkolja a DNS kettős spirálban létrejött kovalens keresztkötést. Ez a kihurkolt szerkezet fog szubsztrátként szolgálni Pol η számára a transzéziós szintézis során, így menekítve az elakadt replikációs villát. A FAN1 lehet az összekötőkapocs a két útvonal között a sejtciklus különböző fázisaiban. Az általunk felállított modell jelentős tudományos betekintést ad a DNS-szálak között létrejött kovalens keresztkötések javításába, és részéleteiben vizsgálja azokat.

Absztrakt (kivonat) idegen nyelven

In our current study, we prove that FAN1 is indeed regulated by the Rad 18 DDT pathway in vivo, and it colocalizes with Ub-PCNA. We demonstrate in vitro that the endonuclease activity of FAN1 can be enhanced by PCNA/Ub-PCNA. Furthermore, we show that both the PIP-box and the UBZ-domain can interact with Ub-PCNA. We could also demonstrate that the digestion specificity of FAN1 can be altered in the presence of PCNA. PCNA is able to position FAN1 to cut at a specific site (after a junction of 4 nt) on the 5’ flap substrate, thus it can facilitate ICL bypass. Furthermore, we compare three TLS polymerases (pol η, pol ι, and pol κ) for bypassing the ICL lesion. Pol η is the one TLS polymerase which is able to process the blocking ICL. We also provide evidence for FAN1-pol η epistasis by cell survival assays and FAN1and Pol η have functional interaction upon cisplatin treatment. To sum up, our current results indicate that FAN1 does not only play a role in the FA pathway, but it also participates in the RAD18 DDT pathway, acting in the rescue of stalled replication. Therefore, here we propose a new model for the function of FAN1: upon encountering ICL lesions, the Ub-PCNA-dependent FAN1 nuclease can unhook the covalent bond between the strands of the DNA helix, the unhooked substrate can be further processed by TLS Pol η, and thus stalled replication can be rescued. FAN1 may be a cross-talk protein which regulates two pathways in different cell cycle stages. Our model provides important scientific insight into the repair mechanism of DNA interstrand crosslinks and reveals fine details of the process.

Tétel nézet