Három-dimenziós in vitro multicelluláris szferoidok fejlesztése és alkalmazása tumorellenes hatóanyagok vizsgálatára

Előnézet	PDF (disszertáció) Download (4MB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (2MB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (743kB) | Előnézet
	Archive (ZIP) (melléklet) Download (1MB)
	PDF (kapcsolódó saját publikációk) Restricted to Csak az archívum karbantartója Download (9MB)

Magyar nyelvű absztrakt

A dolgozat a során a különböző módon előállított háromdimenziós in vitro sejttenyésztési eljárásokkal kialakított multicelluláris szferoidok vizsgálatát végeztem el annak érdekében, hogy összehasonlítsam azokat a normál in vivo fiziológiás szöveti állapottal, valamint a széleskörben használt hagyományos kétdimenziós sejttenyészetekkel. Továbbá igyekeztem bemutatni a kialakított rendszereken, illetve a létrehozott szferoidokon végzett vizsgálatok eredményeit, melyek alapján négy fő megállapításra jutottunk: i. A RAFT TM alkalmazása az egér hasnyálmirigy-szigetek hosszú távú fenntartására kiváló eredményeket mutatott, mivel a szigetek integritása, speciális sejtjeinek inzulin és glükagon termelése legalább tizennyolc napig ex vivo megmaradt. A kapott eredményeink alapján a RAFT TM ígéretes eszköznek bizonyul, mivel a klinikumban nagy igény mutatkozik az olyan terápiák iránt, ahol a cukorbetegek inzulinpótlását a szervezetükbe ültetett inzulin termelő xenograft szigetekkel tudnák pótolni. Tudomásunk szerint csoportunk közleménye volt az első a hasnyálmirigy-szigetek RAFT TM 3D in vitro sikeres fenntartásáról. ii. A 624 gént vizsgáló nanokapilláris qRT-PCR, valamint a 62 gént vizsgáló 1536 qRT-PCR vizsgálatok az in vivo xenograft tumorok és a 3D A549 sejtkultúrák esetében magasabb TMEM45A, SLC16A3, CD66, SLC2A1, CA9 és CD24, valamint alacsonyabb EGFR expressziót mutattak az egyrétegű 2D tenyészetekhez képest. iii. Az alkalmazott többdimenziós egysejt fehérje profil (viSNE) kimutatta, hogy a 3D (Cytodex3 és Nutrisphere) kultúrák átmenetet jelentenek a 2D-ből az in vivo állapot felé a TRA-1-60, TMEM45A, pan-keratin, CD326, MCT4, Gal-3, CD66, GLUT1 és a CD274 kifejeződése alapján. A CA9, CD24 és az EGFR ezzel szemben magasabb kifejeződést mutatott a 3D Cytodex3 és Nutrisphere kultúrákban, mint az in vivo tumorokba. iv. A humán MCF-7 és egér 4T1 emlő daganatsejteket használva igazoltuk a 2D és 3D sejtkultúrák eltérő kemorezisztenciáját. Mivel a szűrés során az újonnan szintetizált imidazo [1,2-b] pirazol-7-karboxamidok potenciális tumorellenes hatásának vizsgálata folyamán a 16 aktív kismolekulából 6 vegyület esetén minimum két és félszeres hatásbéli különbséget mértünk. Ezekben az esetekben 3D tenyészetek kevésbé voltak érzékenyek az adott szerre, beleértve a klinikumban széleskörűen használt és jól ismert doxorubicinre is. Ezzel az általunk létrehozott 3D kultúrákon is igazolva az irodalomban leírt hatás béli különbséget.

Absztrakt (kivonat) idegen nyelven

The main goal of my work was to investigate different multicellular spheroids generated with different three-dimensional in vitro cell culture techniques in order to demonstrate their advantages over the two-dimensional culture method widely used today. In the current work, the results of the experiments carried out on the established spheroids are presented, which led to four main findings: i. The use of RAFT TM provided excellent results in preserving islet spheroid viability, structure integrity and insulin, glucagon production for at least 18 days ex vivo. Based on our data, RAFT can be a promising tool both in research and therapy as well, as there is a great demand in the clinic for therapies where diabetic patients can replace their insulin supply with insulinproducing xenograft islets implanted in their bodies. To the best of our knowledge, our group's findings was first to report the successful maintenance of pancreatic islets using RAFT TM technique in vitro. ii. Gene expression analysis by nanocapillary qRT-PCR (624 genes) and 1536 well high-throughput qRT-PCR (62 genes) resulted in the selection of lung cancer markers associated with higher (TMEM45A, SLC16A3, CD66, SLC2A1, CA9, CD24) or lower (EGFR) expression in vivo or in 3D in vitro models compared to 2D monolayer cultures. iii. The implemented multidimensional single cell proteomic profiling revealed that 3D (Cytodex3 and Nutrisphere) cultures represented a transition from 2D to in vivo situation by intermediate marker expression of TRA-1-60, TMEM45A, pan-keratin, CD326, MCT4, Gal-3, CD66,GLUT1, CD274. In 3D systems CA9, CD24, EGFR showed higher expression than in vivo. iv. Using human MCF-7 and mouse 4T1 mammary tumor cells, we demonstrated the different chemoresistance of 2D and 3D cell cultures. The performed screening investigated that 6 out of the 16 active small imidazo[1,2-b]pyrazole-7-carboxamides molecules had different antitumor activity with minimum two and a half fold difference in potency using 2D and 3D in vitro cultures of same cell lines. In these cases, 3D cultures were less sensitive to the agent of interest, including the widely used and well-known doxorubicin. Our findings showed the reduced chemosensitivity of multicellular spheroids.

Tétel nézet