A nitrogénkötő szimbiózis génjeinek evolúciós és funkcionális vizsgálata Medicago truncatula modellnövényen

Bozsóki Zoltán
A nitrogénkötő szimbiózis génjeinek evolúciós és funkcionális vizsgálata Medicago truncatula modellnövényen.
Doktori értekezés, Szegedi Tudományegyetem.

[img]
Előnézet
PDF (disszertáció)
Download (28MB) | Előnézet
[img]
Előnézet
PDF (tézis)
Download (667kB) | Előnézet
[img]
Előnézet
PDF (tézis)
Download (660kB) | Előnézet

Magyar nyelvű absztrakt

A talaj növények számára felvehető tápanyagtartalma számos termőhelyen korlátozó tényező a növényi fejlődés, produktivitás tekintetében. Erre a kényszerre adott evolúciós léptékű válasz lehet a talajlakó mikroorganizmusokkal létrehozott szimbiotikus asszociáció, mely fontos makroelemeket juttat a növénynek a fotoszintézis cukortermékeiért cserébe. Egy ősi együttélési forma a gombákkal kialakított arbuszkuláris mikorrhiza szimbiózis. Ennek révén elsősorban foszfátvegyületekhez jut a növény. Kialakítására a szárazföldi növényfajok túlnyomó hányada képes. Ez a tulajdonság feltételezhetően már jelen volt a szárazföldi növények közös ősében is, vagyis azok a fajok, melyek ma nem léphetnek szimbiózisra mikorrhiza gombákkal, e képességüket elveszítették az evolúciójuk folyamán. Emellett a törzsfejlődés során sokkal később egy másik szimbiotikus együttélési forma is megjelent bizonyos nitrogénkötő talajbaktériumok és közeli rokon növényfajok egy szűk csoportja között. A nitrogénkötő endoszimbiózis kialakítása folyamán egy új növényi szerv képződik, a gyökérgümő. A szimbionta baktériumok ebben végzik a légköri dinitrogén ammóniává történő redukcióját, ami a növény számára is hasznosítható szerves molekulákba épül be. E két szimbiózis folyamán működő növényi gének vizsgálata felfedte, hogy bizonyos gének mindkét együttélés kialkításához nélkülözhetetlenek. Ezek az ún. közös szimbiotikus útvonal génjei. A jelenleg elfogadott tudományos nézet szerint feltételezhető, hogy az ősibb mikorrhiza rendszer már meglévő molekuláris apparátusának bizonyos elemeit felhasználva fejlődött a nitrogénkötő endoszimbiózis. Ennek a folyamatnak a megértéséhez szeretnénk közelebb jutni ezeknek a géneknek és géntermékeknek az evolúciós és funkcionális vizsgálatával. Evolúciós elemzésünkhöz kiválasztottunk 16 M. truncatula gént, melyek fehérje termékei változatos szerepet töltenek be a nitrogénkötő szimbiózis kialakítása folyamán. Ezek között szerepelnek a nitrogénkötő szimbiózisra specifikus, és a közös szimbiotikus útvonalba tartozó gének is. Kiválasztottunk továbbá 12, a nitrogénkötő szimbiózisban ismert szereppel nem rendelkező szekvenciát, melyeket kontrollokként alkalmaztunk. A kiválasztott gének fehérjetermékeinek szekvenciájával adatbáziskereséseket végeztünk a zárvatermők rendszertani fájának különböző csoportjaiból választott tíz növény szekvenciái között, melyek genomszekvenálása már befejezett, vagy közel befejezett fázisban tartott. A fajok között nitrogénkötő szimbiózisra képes, és arra képtelen kétszikű, illetve egyszikű növények szerepeltek. Mindegyikük képes mikorrhiza szimbiózis kialakítására, kivéve az A. thaliana-t, mely nem képes egyik szimbiózisra sem. Minden genomból kiválasztottunk egy-egy olyan szekvenciát, mely hosszban és aminosav összetételben a referenciaként használt M. truncatula aminosav szekvenciához a legnagyobb hasonlóságot mutatta. Ezeket a továbbiakban feltételezett ortológokként kezeltük. Közülük reciprok BLAST keresésekkel szűrtük ki a fals ortológ találatokat. A legtöbb ortológ kópia az A. thaliana genomjából hiányzott, mely sem nitrogénkötő, sem mikorrhiza szimbiózis kialakítására nem képes. Vélhetően ez utóbbi képességet törzsfejlődése során elveszítette. Ezzel összefüggésben veszíthette el szimbiotikus génjeinek jelentős hányadát is. Azok az ortológok, melyek még jelen vannak a genomjában, feltehetőleg egyéb fontos, nem szimbiotikus funkcióval rendelkeznek. Az összegyűjtött leghasonlóbb szekvenciákat először hosszukban hasonlítottuk össze annak eldöntésére, hogy történtek-e nagyobb, akár teljes domén(eke)t érintő változások bizonyos fehérjék fejlődése során. Jelentősebb hosszbeli eltérést csupán néhány szimbiotikus fehérje homológja esetén tapasztaltunk. A referencia szekvenciához képest több mint 20%-os eltérést mutatott három A. thaliana paralóg és az egyszikű DMI2 ortológok. Szakirodalmi adatok alapján tudjuk, hogy a DMI2 ortológok a növények evolúciója folyamán úgy fejlődtek, hogy extracelluláris doméneket szereztek. Ezek közül a hosszabb szekvenciák képesek menekíteni a megfelelő L. japonicus szimbiotikus mutánsok hibás gümőző és mikorrhiza fenotípusát, míg a rövidebb egyszikű DMI2 ortológ szekvencia csak a mikorrhiza szimbiózis hibáját tudja komplementálni. Az egyszikűek NSP2 homológjai, és a Z. mays ERN1 szekvenciája mutatott még 10-15%-os hosszeltérést az adott referenciához képest, InterPro doménkeresésekkel azonban nem tudtunk extra doméneket kimutatni ezekben a fehérjékben. Emellett szakirodalomból tudjuk, hogy az O. sativa hosszabb NSP2 homológja teljes mértékben képes komplementálni a L. japonicus nsp2 mutánsokat. A kiválasztott feltételezett ortológ szekvenciákat egyenként, aminosav szinten, páronkénti illesztésben hasonlítottuk össze a megfelelő M. truncatula referencia fehérjével. Az egyes illesztési pozíciókban kapott megegyező aminosavak százalékos aránya az ún. ID érték, ezt használtuk a géntermékek további elemzésében. Az egyes géntermékek ID adatait a vizsgálatba vont fajoknak a referencia M. truncatula-tól számított rendszertani távolsága szerint rendeztük sorba. Az egyes géntermékek evolúciós módosulásait azok ID értékeit követve vizsgáltuk a fajok során át, és két alkalommal tapasztaltunk jelentősebb változást az adatokban. Az első a nitrogénkötő szimbiózisra képes fajok és az egyéb, erre nem képes kétszikűek között, a második a kétszikű és egyszikű fajok értékei között jelentkezik. Az ID értékekben tapasztalható hirtelen csökkenés oka lehet az adott géntermék növényi evolúció folyamán mutatott általánosan gyors változása, vagy a géntermékeket formáló bizonyos különbségek okai lehetnek egy adott funkcióból eredő specifikusan ható evolúciós erők is. Esetünkben ez a nitrogénkötő szimbiózis kialakításának képessége, melynek nyomait a pillangósvirágú növények és az egyéb kétszikűek közti értékek között találhatjuk. A kétszikűek és egyszikűek között pedig két olyan csoport nem gümőző fajainak értékei között figyelhetjük meg a változást, ahol a nitrogénkötő szimbiózist formáló szelekciós erők valószínűleg nem hatottak. A mért ID érték változás mértéke itt közvetlenül utalhat az adott géntermék evolúciójának sebességére. A fajcsoportok közötti ID érték változásokra jellemző mintázat alapján az egyes fehérjéket három csoportba soroltuk. Az A (szimbiotikus) és az A’ (kontroll) csoportokba olyan géntermékek kerültek, melyeknél a gümőző és nem gümőző kétszikű fajok között, valamint a kétszikű és egyszikű fajok között is csekély mértékű az ID értékek változása. Az adott géntermék lassan változott a zárvatermő növények evolúciója során, szekvenciája jól konzervált. Mivel szekvenciája a gümőző fajokban sem változott meg lényegesen más kétszikűekhez viszonyítva, feltételezhető, hogy a nitrogénkötő szimbiózisban betöltött működéséhez nem volt szükség kiterjedt szekvencia változásokra. Ez arra utalhat, hogy az A kategóriába sorolt szimbiotikus fehérjék csoportjában a nem gümőző fajokból vett ortológok megfelelő kifejeztetés mellett nagy eséllyel képesek ellátni a gümőző növényekben a szimbiotikus feladatokat. Ezt a szakirodalomban elérhető transz-komplementációs kísérletek eddigi eredményei megerősíteni látszanak. A B, illetve B’ csoportba azok a szekvenciák tartoznak, amelyek jelentős ID érték csökkenést mutattak a gümőző és nem gümőző kétszikű fajok között, azonban az értékeik nem változtak számottevően a kétszikűek és egyszikűek között. Ezekre a géntermékekre feltehetőleg nem jellemzőek a gyors evolúciós változások, ugyanakkor jelentős szekvencia eltérések jelentek meg a gümőző fajokban. Ez jelezheti azt, hogy a bekövetkezett szekvencia változások - legalább részben - a fehérjék nitrogénkötő szimbiózisban végzett működéséhez szükségesek. Ha ez igaz, akkor csak kicsi a valószínűsége, hogy e fehérjék nem-gümőző növényekből származó ortológjai képesek lennének szimbiotikus működést elvégezni a pillangósvirágúak nitrogénkötő szimbiózisa során. Ezzel összhangban van az, hogy a szakirodalomban elérhető transz-komplementációs vizsgálatok többségében a B kategóriába sorolt pillangósvirágú gének nem gümőző fajokból vett ortológjai csak részlegesen, vagy egyáltalán nem voltak képesek komplementálni a megfelelő, nitrogénkötő szimbiózisban mutáns pillangósvirágú növényeket. A C és C’ kategória génjei, a mindkét vizsgált fajcsoport határon jelentékeny ID érték esést mutató szekvenciák, feltételezhetően gyorsan változtak a növényi evolúció folyamán. Ha emellett megtartották az eredeti funkciójukat, akkor valószínűleg jelentős szekvencia flexibilitás jellemzi őket. Flexibilitásuk révén könnyen változhattak, és változásuk eredményeképp akár új működéseket is képesek lehettek elvégezni. Ilyen funkció lehetett a gümőző fajokban lévő kópiák nitrogénkötő szimbiózisban betöltött szerepe is. Ez alapján a C kategória elemeinél két lehetőséget is figyelembe kell vennünk: 1) vagy a B kategória tagjaihoz hasonlatosan, a szekvencia evolúciójuk folyamán specializálódtak a nitrogénkötő szimbiózisra, vagy 2) a változás inkább a gyors evolúciós sebesség következménye, mely nem eredményezett a szimbiózis szempontjából minőségi változást a működésükben. A C kategória tagjaival végzett komplementációs tesztek eddig kivétel nélkül az utóbbi eshetőséget erősítik: a nem gümőző növényekből vett ortológ szekvenciák transz-komplementációs tesztekben pozitívnak bizonyultak. A felállított evolúciós kategóriák megtalálhatóak mind a szimbiotikus, mind a kontroll szekvenciák között. De míg a kontrollok zöme a lassan változó, jól konzervált szekvenciák közé volt sorolható (A’), a szimbiotikus szekvenciák inkább a B vagy a C kategóriákba kerültek. Ez utalhat arra, hogy specifikus változások kellettek ahhoz, hogy ezek a fehérjék a szimbiózisban végzett működésüket megvalósíthassák, illetve utalhat akár arra is, hogy a gyors szekvencia evolúciót mutató géntermékek preferenciálisan verbuválódtak a nitrogénkötő szimbiózis kialakításához szükséges gének sorába. Egy részletesebb filogenetikai elemzést és funkcionális vizsgálatokat a LIN géncsalád tagjaival végeztünk. A M. truncatula LIN gén egy, a nitrogénkötő endoszimbiózis kialakításában nélkülözhetetlen szerepet játszó fehérjét kódol. A LIN génnek azonosítottuk a paralógját, melyet LIN2-nek neveztünk el. A LIN és LIN2 fehérjék doménfelépítésükben igen hasonlóak: tartalmaznak egy U-box és egy Armadillo domént, valamint több WD40 domént. Feltételezhetően mindketten E3 ubikvitin ligázok. A szárazföldi növényeket jól reprezentáló szekvenált genomokból adatbázis keresésekkel összegyűjtöttük az elérhető LIN és LIN2 szekvenciákat. A vizsgált kétszikűekben jellemzően egy LIN és egy LIN2 ortológot találtunk. Az adott szekvenciák között fennálló ortológ/paralóg viszonyt a szekvencia hasonlóságon túl, az elérhető szekvenciák felhasználásával készült NJ filogenetikai fa topológiája, és a géneket hordozó kromoszóma szakaszok összevetésével végzett szinténia vizsgálat is megerősítette. Az elérhető egyszikű genomokban csak egyetlen LIN homológot találtunk, melyek a filogram és a szinténia analízis alapján is LIN2 ortológoknak bizonyultak. A LIN és LIN2 szekvenciát megtaláltuk a zárvatermők rendszertani fájának legbazálisabb kládjába, a boglárkavirágúak (Ranunculales) közé sorolt kolorádói kék harangláb (Aquilegia caerulea) genomjában, illetve az egy- és kétszikű fejlődési vonalak szétválása előtt jóval korábban elkülönült harasztok közé sorolható csipkeharaszt (Selaginella moellendorffii) szekvenciák között is. Ez arra utal, hogy LIN és LIN2 ortológja már jelen volt a magasabbrendű növények (Tracheophyta) közös ősének genomjában. Ezen kívül azt is valószínűsíti, hogy vagy bizonyos egyszikű vonalak, vagy akár már az egyszikűek közös őse elveszítette a LIN kópiát. A LIN gén nitrogénkötő szimbiózis során végzett működésének evolúciós vizsgálatához ortológjait klónoztuk a nem gümőző kétszikű szőlő (Vitis vinifera), és a vénuszhaj páfrány Adiantum capillus-veneris fajból is. Ezek a M. truncatula fehérjével összevetve igen konzervált doménfelépítést mutattak. Megfelelő kifejeztetés mellett mindkét ortológ kópia képes volt menekíteni a M. truncatula lin mutáns növények nitrogénkötő szimbiózis-defektív fenotípusát. Ennek fényében elmondhatjuk, hogy a növények evolúciója folyamán a LIN ortológ fehérjék szekvenciájában bekövetkező változások alapvetően nem változtatták meg azt a működést, melyet LIN a nitrogénkötő szimbiózisra képes fajokban végez. Továbbá ez a működés a LIN ortológok evolúciója folyamán igen korán, már jóval a nitrogénkötő szimbiózis első megjelenése előtt kialakult. A LIN2 génről, illetve fehérje termékéről kísérletes adat korábban nem állt rendelkezésre, ezért elvégeztük annak analízisét. Riportergén vizsgálatokban a M. truncatula LIN2 gén 2156 bp-os promóter szakasza erős aktivitást mutatott az oldalgyökér kezdeményekben a korai sejtosztódásoktól egészen a kifejlett állapotig, és hasonló módon volt nyomon követhető a gümőfejlődés teljes folyamatán keresztül. Ez az aktivitás később fokozatosan a merisztematikus sejteket tartalmazó területekre húzódott vissza mind a kifejlett oldalgyökér, mind az érett gümő esetében. Ezek alapján LIN2 potenciálisan részt vehet a sejtosztódáshoz kapcsolódó feladatok ellátásában. Emellett a LIN2 promóter aktívnak mutatkozott a szimbiotikus infekció folyamán is, annak mintegy előfutáraként az infekciós fonal előrehaladásának útját övező sejtekben, de annak mindig előtte járva kapcsolt be, míg a baktériumok el nem érték a gümőprimordiumot. Ez a mintázat utalhat arra, hogy a LIN2 fehérjének is lehet szerepe a szimbionták infekciója folyamán (is). Heterológ rendszerben végzett sejten belüli lokalizációs vizsgálatokkal, N. benthamiana levélen, a M. truncatula LIN2 fehérjét kimutattuk a sejtmagban, az endoplazmatikus retikulumban és a citoplazmában is. A fehérje tömege 149 kDa, az ilyen méretű molekulák már csak aktív transzporttal juthatnak át a sejtmag membrán pórusain, de az in silico vizsgálatok nem prediktáltak magi lokalizációs szignált LIN2 szekvenciáján. Elképzelhető, hogy a LIN2 fehérje az egér β-kateninhez hasonló módon, Armadillo doménje által jut keresztül a sejtmagi pórus komplexeken, akár más fehérjéket is magával szállítva. A M. truncatula inszerciós mutagenezis program adatbázisában számos, a LIN2 génben Tnt1 retrotranszpozont hordozó vonalat azonosítottunk. Ezek közül kettőt részletesen elemeztünk. A lin2-1 és lin2-2 mutánsok sem általános fejlődési, sem a nitrogénkötő szimbiózis folyamán megfigyelhető rendellenességet nem mutattak, ami arra utal, hogy a LIN2 gén nem nélkülözhetetlen a funkcionális nitrogénkötő endoszimbiózis kialakításához, illetve a normális egyedfejlődéshez. Tekintve, hogy a LIN és LIN2 fehérjék doménfelépítése és promóter aktivitása nagyon hasonló, elképzelhető, hogy LIN képes elvégezni LIN2 feladatát is, így elkendőzi a lin2 mutánsokban a LIN2 géntermék kiesésének következményeit. Ez, legalábbis részben, fordított módon is elképzelhető. A lin mutáns növényekben, melyekben csak a LIN hibás, LIN2 épen jelen van a M. truncatula genomban, a LIN2 nem képes menekíteni a lin mutációt. Nem kizárt azonban, hogy bizonyos funkciókat a LIN és LIN2 redundánsan lát el. Ezen gének és fehérjék funkciójának vizsgálata a jövőben folytatódik a kutatócsoportban.

Absztrakt (kivonat) idegen nyelven

Soil nutrient availability is a major limiting factor in plant growth and productivity at many areas under agricultural cultivation. An evolutionary answer to this demand is the symbiotic association of plants with soil microbes that provide valuable macronutrients to the host for a share of the sugar compounds of photosynthesis, as an exchange. An ancient type of coexistence is the arbuscular mycorrhiza symbiosis formed with fungi that provide mainly phosphates to the plants. The majority of land plant species are able to form mycorrhiza symbiosis. It is hypothesized that this capability was present already in the common ancestor of all land species, hence those recent species that do not form mycorrhiza, most probably lost this ability during their evolution. In addition, much later in evolution, another form of symbiotic co-existence appeared between certain nitrogen fixing soil bacteria and a group of closely related plant species. During nitrogen fixing symbiosis a new organ, the root nodule is formed, where the symbiotic bacteria reside and fix atmospheric nitrogen, which is than converted to organic molecules that can be used by the plant. Analyzing the plant genes needed for these symbioses revealed that some of them are indispensable for both types of co-existence. These are the elements of the so-called common symbiotic pathway. It is hypothesized that the phylogenetically much younger nitrogen fixing symbiotic system was developed on the molecular grounds of the more ancient mycorrhiza symbiosis, recruiting elements from the already existing signaling pathways. We aim to understand this process through the evolutionary and functional analyses of these genes and gene products. For our evolutionary analysis we chose 16 M. truncatula genes coding for proteins with diverse functions during nitrogen fixing symbiosis. Most of them are specific for nitrogen fixing symbiosis, but some elements are part of the common symbiotic pathway. Additionally, we chose 12 sequences with no proven symbiotic function, to use them as controls. The selected symbiotic and control M. truncatula sequences were used as queries while searching for their homologs in the available genome sequences of ten plant species from different groups of the angiosperm phylogenetic tree. Two other legume species, that are able to form nitrogen fixing root nodule symbiosis, were picked, and other non-nodulating dicot and also monocot species were selected for further analysis. All these species were capable of mycorrhiza symbiosis with the one exception of A. thaliana that is incapable of either the mycorrhiza or the nitrogen fixing symbiosis. After the BLAST searches with the M. truncatula amino acid sequences a single homologous sequence from each plant genome - that showed the highest similarity to the respective reference sequence - was chosen to work with. These homologous sequences were considered as putative orthologs. Reciprocal BLAST searches were used to identify and filter out the false ortholog hits. The general model plant A. thaliana revealed the highest number of missing orthologous sequences. It is unable to form even mycorrhiza symbiosis, most probably lost this ability during its evolution, and supposedly, in connection with this, also lost the vast majority of its symbiosis related genes. Those orthologous sequences that are still present in the A. thaliana genome may have an important role in other, non-symbiotic function. First we compared the collected most similar sequences in their length on the amino acid level to see whether some of them went through larger changes in their length during their evolution that could possibly affect their domain composition. Considerable length differences could only be detected for orthologous sequences for some symbiotic proteins. More than 20% difference in length compared to the respective reference M. truncatula sequence were shown for three A. thaliana paralogs, and the monocot DMI2 orthologous sequences. We know from the literature that DMI2 orthologs developed by extracellular domain acquisition during plant evolution. Among these, the ones with longer sequences were able to complement both the defective mycorrhiza and nitrogen fixing symbiosis phenotype of the respective L. japonicus mutants, while the shorter monocot orthologous sequence could only restore mycorrhiza symbiosis in trans-complementation experiments. Moreover, the two monocot NSP2 homologs and the Z. mays ERN1 sequence showed 10-15% difference in length compared to the respective reference sequence, but no extra domains in these proteins could be detected by InterPro database analysis. Also it is known from the literature that the extended length O. sativa NSP2 ortholog with extended length was able to fully complement the L. japonicus nsp2 mutants. The selected putative orthologs were compared to the respective M. truncatula reference sequence at amino acid level one by one, in pairwise alignments. The percent proportion of the identical amino acids among the alignment positions resulted in the ID values, while similar amino acid substitutions in similarity (SIM) values that were all organized in a table. The more stringent ID values were used for subsequent analysis of the variations in the gene products from the chosen plant species through the phylogenetic tree. We arranged the ID values of the given putative orthologous proteins according to the species showing an increasing phylogenetic distance from the reference M. truncatula, then the modifications of the gene products were analyzed by following the changes in their ID values through the species tested. There were two positions where greater changes were experienced. The first one was between the values of nodulating and non-nodulating dicots along the row of tested species, while the second one was between dicots and monocots. Large drops in the changes of the ID values could be due to generally occurring fast modifications of a given gene product during plant evolution, which can be mirrored by the differences of the ID values between the dicots and the monocots. Alternatively, in some cases specifically acting evolutionary forces could cause particular differences in certain gene products for a particular function. In our example this latter is the ability to form nitrogen fixing symbiosis, which reflected in the ID value changes between the nodulating and non-nodulating dicot species. Based on the deviations in ID values detected in our data between the different groups of species the proteins fell into three categories. The A (symbiotic) and A’ (control) categories consist of gene products for which the ID value changes are both moderate between the nodulating and non-nodulating dicot species, and between the dicots and monocots. The amino acid composition of these gene products changed slowly during the evolution of angiosperm species, so their sequences are well conserved. The sequences of these proteins did not show great changes in the nodulating species compared to other dicots, i.e. they did not need extensive sequence modifications to be able to fulfill their function in nitrogen fixing symbiosis. This suggests that for symbiotic proteins in category A, the orthologous counterparts taken from non-nodulating species can possess a high probability for being capable of fulfilling the symbiotic functions. The results of trans-complementation experiments available in the literature so far are confirming this hypothesis. The sequences that show considerable fall in the ID values between nodulating and non-nodulating species, but in the same time barely changed between dicots and monocots, belong to categories B and B’, respectively. These sequences are most probably members of slow evolving proteins showing extensive amino acid changes in the nodulating species. Therefore it is highly possible that the changes accumulated in their sequences during their evolution (at least in part) were needed for them to be able to achieve their function in nitrogen fixing symbiosis. If that was true, it is rather unlikely that their orthologs from non-nodulating species could accomplish the symbiotic functions of their legume counterparts. In accordance with this, several papers in the literature reported trans-complementation studies using orthologous sequences of symbiotic proteins of category B from non-nodulating genomes that could only partly, or could not complement at all the respective symbiotic mutant legume plants. Gene products of categories C and C’ show remarkable fall in ID values at both borders of the above mentioned groups of species, suggesting fast evolution for these sequences during plant evolution. Despite of these variations if at the same time these proteins retained their original function, they demonstrate extensive compositional flexibility. Due to this flexibility they could easily change, and even gain new functional abilities through their changes. Such a new application of a function might be what the orthologous copies of the nodulating species perform during symbiosis. Considering this, there are two possibilities with the members of category C: 1) either these gene products went through sequence specialization during evolution to be able to fulfill functions in nitrogen fixing symbiosis, similarly to category B sequences, or 2) the changes in their sequences are simply due to their fast evolution and did not result in symbiosis-specific changes in their functional capabilities. Complementation studies available in the literature done with category C sequences are without exception confirming so far the latter possibility. All of their tested orthologs from non-nodulating species showed to be fully successful in rescuing the respective legume symbiotic mutants. Each of the evolutionary categories specified in this study can be found among the symbiotic (A, B, C) and also the control (A’, B’, C’) sequences. However, while the majority of the control sequences belonged to the slow evolving, well-conserved category (A’), the symbiotic gene products mostly fell into categories B or C. This suggests that most of the sequences that are essential in nitrogen fixing symbiosis had to acquire specific sequence changes to be able to accomplish their symbiotic function, or alternatively, fast evolving sequences were preferentially recruited. A more detailed phylogenetic study and functional analyses were performed on the members of the LIN gene family. The M. truncatula LIN gene codes for a protein indispensable for nitrogen fixing symbiosis. Searching for LIN homologs in sequence databases led to the identification of its paralogous counterpart in M. truncatula that was designated as LIN2. The LIN and LIN2 proteins are very similar in domain composition: both consist of a U-box and an Armadillo domain, together with WD40 repeats at their C-terminus. Both are putative E3 ubiquitin ligases. The available LIN and LIN2 sequences were collected from representatives of the land plant species with sequenced genomes and a detailed analysis was performed with them. In the dicot species tested generally one LIN and one LIN2 ortholog was identified. Beyond the sequence similarities the prepared Neighbor-Joining phylogenetic tree consisting of the available LIN homologs and synteny data from comparison of the chromosomes carrying the sequences confirmed the ortholog/paralog relationship between the particular gene products. The tested monocots carried only one LIN homolog counterpart, which proved to be orthologous with the LIN2 genes according to the phylogram and the synteny analysis as well. LIN and LIN2 orthologs can also be found in the most basal clade of angiosperms, in the Aquilegia caerulea (Ranunculales) genome, as well as among a group that diverged much earlier than the monocot-dicot split, the lycophytes, in the Selaginella moellendorffii genome. This implied that LIN and LIN2 had to be present in the common ancestor of higher plants (Tracheophyta). Also, it suggests that either some monocot lineages or already the common ancestor of all monocot species lost the LIN orthologous copy. However, more information from fully sequenced genomes are needed from distinct groups of the monocot phylogenetic tree to resolve this. To analyze the functional aspects of the evolutionary changes in the symbiotic LIN gene, we identified and cloned its orthologs from the non-nodulating dicot Vitis vinifera and the fern Adiantum capillus-veneris. Both showed highly conserved domain composition compared to the M. truncatula protein. Providing appropriate expression both orthologous copies were able to rescue the nitrogen fixing symbiosis-defective lin mutant plants in trans-complementation experiments. This indicated that the sequence variations found in LIN orthologs did not affect the function of the symbiotic LIN copies that is needed for nitrogen fixing nodule formation. In addition, this function appeared early during plant evolution, way before the first appearance of nitrogen fixing symbiosis, and so it was recruited for this process. No experimental data was available for the LIN2 gene and gene product earlier, so we performed its analysis. The activity of a 2156 bp DNA fragment from the 5’ UTR promoter region of the M. truncatula LIN2 gene was tested in fusion with a reporter gene using hairy root transformation. This promoter showed high activity in lateral root primordia starting from the very early cell divisions until the fully developed state in M. truncatula roots. Similarly, the promoter showed to be active during the entire process of nodule development. At later steps this activity became restricted to the meristematic regions both for the developed lateral roots and the nodules as well. Based on these results LIN2 potentially could have a role during cell division or cell cycle control. Moreover, the LIN2 promoter was active during symbiotic infection. It was active in the cells surrounding the infection thread, but always preceding its path until the bacteria reached the nodule primordium. This may suggest a possible role for LIN2 upon microsymbiont infection. We analyzed the subcellular localization of the M. truncatula LIN2 protein in a heterologous system, since the protein could not be detected in M. truncatula hairy roots. In N. benthamiana leaves the signals of the fluorescent tagged gene product were perceived in the cytoplasm, the ER and the nucleus. The molecular mass of the M. truncatula LIN2 protein is 149 kDa. Molecules of this size can only pass through the nuclear pore complexes by active transport mechanisms, but no nuclear localization signal was detected on its amino acid sequence. It is possible that similarly to β-catenin, LIN2 could pass the nuclear pores with the help of its Armadillo domain, even simultaneously binding to other molecules and carrying them as cargo. Screening the M. truncatula insertional mutant database we found several lines carrying a Tnt1 retrotransposon insertion in the LIN2 gene. We chose two of them for detailed analysis. The lin2-1 and lin2-2 mutant plants did not show any kind of general developmental anomalies or defects during nitrogen fixing symbiosis. This suggested that the LIN2 gene itself is not indispensable for the establishment of functional nitrogen fixing symbiosis. Considering that the expression pattern and also the domain composition of LIN and LIN2 proteins are very similar, it is possible that LIN may be capable of fulfilling the function of LIN2, so conceals the phenotypic consequences of disrupting the LIN2 gene function in lin2 mutant plants. This, at least in part, may be possible on the other way around too. In lin mutant plants in which only the LIN gene is defective, but LIN2 is present in an unaffected form in the M. truncatula genome, LIN2 is not able to rescue the lin mutation. However, it is possible that LIN and LIN2 accomplish some functions redundantly. The research revealing the function(s) of these genes and proteins is continued in our laboratory.

Mű típusa: Disszertáció (Doktori értekezés)
Doktori iskola: Biológia Doktori Iskola
Tudományterület / tudományág: természettudományok > biológiai tudományok
Magyar cím: A nitrogénkötő szimbiózis génjeinek evolúciós és funkcionális vizsgálata Medicago truncatula modellnövényen
Idegen nyelvű cím: Evolutionary and functional studies on nitrogen fixing symbiotic genes of the model legume: Medicago truncatula
Témavezető(k):
Témavezető neveBeosztás, tudományos fokozat, intézményEmail
Dr. Endre Gabriellatudományos főmunkatárs, PhD, MTA SZBK Genetikai Intézetendre.gabriella@brc.mta.hu
EPrint azonosító (ID): 4049
Publikációban használt név : Bozsóki Zoltán
A feltöltés ideje: 2017. szept. 08. 12:37
Utolsó módosítás: 2017. szept. 08. 12:37
URI: http://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/4049
Védés állapota: nem védett

Actions (login required)

Tétel nézet Tétel nézet

Letöltések

Letöltések havi bontásban az elmúlt egy évben