Az importin-α2 paralóg-specifikus szerepe és összehangolt együttműködése az importin-β/Ketel génnel az ecetmuslica korai embrionális fejlődésében

Viragh Erika
Az importin-α2 paralóg-specifikus szerepe és összehangolt együttműködése az importin-β/Ketel génnel az ecetmuslica korai embrionális fejlődésében.
Doktori értekezés, Szegedi Tudományegyetem.
(2013)

[img]
Előnézet
PDF (disszertáció)
Download (29MB) | Előnézet
[img]
Előnézet
PDF (tézis)
Download (357kB) | Előnézet
[img]
Előnézet
PDF (tézis)
Download (413kB) | Előnézet

Absztrakt (kivonat) idegen nyelven

ÖSSZEFOGLALÓ A Ran szabályozása mellett az importinok végzik a makromolekulák aktív szállítását a sejtmagi transzport folyamatokban. A citoplazmában kialakult hármas komplexben az Imp-α közvetíti az NLS szekvenciával rendelkező célfehérjék és az Imp β közötti kapcsolatot. Az utóbbi évek kutatásai alapján körvonalazódott, hogy az Imp-α/Imp-β a sejtosztódási folyamatok térbeli- és időbeli koordinálásában is részt vesz, mégpedig az osztódási orsót megszervező SAF és MAP fehérjék aktivitásának szabályozásán keresztül. Az ecetmuslica egy imp-β és három imp-α génnel rendelkezik. Az imp-β és imp-α3 főként a sejtmagi transzportban, míg az imp-α1 a spermatogenezisben lát el specifikus feladatot. Ugyanakkor, az imp-α gének szerepét a Drosophila embrió korai osztódásai során eddig még nem vizsgálták. Korábban, laboratóriumunkban P elem mutagenezis során azonosítottuk az imp α2 gén Drosophila ortológját, és részletes vizsgálatával felderítettük a muslica petefejlődésében betöltött speciális szerepét (Gorjánácz et al., 2002; Török et al., 1995). A homozigóta imp-α2D14 null mutánsok felnőtt egyeddé fejlődnek, viszont a nőstények 100%-ban sterilek, többségük egyáltalán nem is rak petét. A nagyon ritkán mégis kialakuló peték súlyos fejlődési rendellenességet mutatnak, amelynek oka a gyűrűcsatornák beszűkülése a petefejlődés során. Ezt a hibát sem az imp-α1, sem az imp α3 nem tudta menekíteni. Az imp-α2 kis NLS-kötő régióját érintő, illetve az Imp-β kötésért felelős, IBB doménjét kiejtő mutáns transzgének kifejeztetése normális morfológiájú, érett petét eredményez, viszont a lerakott petékből nem fejlődnek embriók (Gorjánácz et al., 2006). Ez az eredmény felvetette annak lehetőségét, hogy az importinok mitózisban, és azon belül az osztódási orsó kialakulásában betöltött szerepét in vivo vizsgáljuk meg Drosophila melanogaster-ben. Dolgozatomban az imp-α2 korai embrionális funkcióit mutatom be, az imp-β-val létrejött genetikai interakcióján keresztül, illetve, sejtbiológiai és biokémiai módszerek segítségével. Munkánk az imp-α2 gén és az imp-β Drosophila ortológja, az imp-βKetel gén közötti genetikai kölcsönhatás vizsgálatával kezdődött. Az imp-α2 gén imp-α2D14-es null allélje, és hat recesszív imp-βKetel allél (imp-βKetRP13, imp-βKetRX13 és imp-βKetRE34 – a domináns nősténysteril imp-βKetD revertánsai –, illetve imp-βKetc02473, imp-βKete02657 és imp-βKete03750 – piggyBac inszerciók) különböző kombinációit hordozó, transzheterozigóta anyáktól származó embriók fejlődését követtük nyomon. A fenti kombinációk közül egyedül az imp-α2D14/imp-βKetRE34 eredményezett embrióletalitást, amelyet mind az imp-α2, mind az imp-βKetel vad alléljeinek transzgénikus kifejeztetése egyaránt menekített, jelezvén, hogy az Imp α2 és Imp βKetel fehérjék koordinált együttműködése kritikus a muslica korai embrionális fejlődésében. Az imp-βKetRE34 allélban azonosítottunk egy második mutációt, a D725N helyettesítést, amely az Imp-βKetel Imp-α2-kötő doménjében található. Az Imp-βKetel fehérje in silico és biokémiai módszerekkel történő vizsgálata szerint az Imp-βKetRE34 és a vad Imp βKetel fehérje az Imp-α2 IBB doménjét ugyanolyan erősen köti. Ugyanakkor, az N725 aminosav olyan, új, molekulán belüli, szerkezetmódosító kötéseket alakít ki, amelyek feltehetően javítanak az Imp-βKetD rendellenesen nyitott konformációján, ezáltal csökkentve a domináns nősténysteril Imp-βKetD fehérje mérgező hatását. A Imp βKetRE34 szerkezeti módosulása ugyanakkor, nem állítja vissza teljesen a vad típusú Imp βKetel molekulára jellemző fehérje kötési flexibilitást, amint arra a RanGTP és RanGDP fehérjékhez történő megemelkedett kötési hajlandósága is rávilágít. Feltehetően ez az oka az imp-βKetRE34 szemi-domináns természetének. Ezt a feltételezésünket támasztja alá, hogy a RanGTP szintjének csökkentése (a Bj1/RCCI funkcióvesztéses mutációja révén) szuppresszálta, míg annak növelése (RanGap funkcióvesztéses mutációk által), erősítette az imp-βKetRE34 antimorf fenotípusát. imp-α2, imp-α1 és imp-α3 klasszikus funkcióvesztéses allélok imp βKetRE34-el transzheterozigóta kombinációja esetén, vagy mindhárom imp-α paralóg imp βKetRE34 háttéren történő, ovárium-specifikus RNS csendesítésekor, csak az Imp α2 szintjének csökkentése okozott embrióletalitást. Továbbá, az imp-α2D14/imp-βKetRE34 allélkombináció erős embrióletális fenotípusát, az azonos szinten és mintázatban kifejeztetett, UTRΔimp-α transzgének közül, kizárólag az UTRΔimp-α2 menekítette. Az Imp-α2 magas koncentrációban van jelen a 0-2 órás embrió szinciciális plazmájában. A gyors osztódási ciklusok során a mitotikus orsó mikrotubulusiahoz kötődik, míg interfázisban a sejtmagban határozottan feldúsul. A genetikai analízisek eredményeivel párosulva ez a sejtciklus-függő eloszlási mintázat egyértelműen rávilágít a muslica imp α2 génjének paralóg-specifikus szerepére az embrió korai fejlődési szakaszában a szinkron magosztódások során. A mutáns imp-α2 (imp-α2NLSB‾, imp-α2SNLSB‾, imp-α2ΔIBB, imp-α2CASB‾) transzgének analízisét imp α2D14/imp-βKetel null érzékenyített háttéren végeztük, recesszív imp-βKetel allélokkal (imp-βKetRX13, imp-βKetRP13, imp-βKetc02473, imp-βKete02657, imp-βKete03750) kombinációban. Az imp-α2 NLSB és SNLSB doménjeinek inaktiválása az imp-βKetel gén csökkentett dózisával párosulva embrióletalitást okozott. Kimutattuk az imp-α2NLSB‾ transzgén antimorf hatását is imp-α2D14/+ heterozigóta háttéren, amit az imp-βKetel gén lecsökkent dózisa felerősített. A genetikai elemzés eredményei az NLSB domén jelentőségét hangsúlyozzák a szinciciális embrióban zajló gyors sejtmagosztódásokban és a mitotikus fehérjék (lamin, CP190 és ISWI) NLS-függő immun-precipitációja ezzel teljesen összhangban áll. Az imp-α2ΔIBB mutáns kifejeztetésének imp α2D14/imp-βKetel null háttéren nem volt hatása az embriók fejlődésére, ami azzal magyarázható, hogy IBB domén hiányában az Imp-α2 nem tud az Imp-βKetel fehérjéhez kötődni, míg a másik három, intakt IBB doménnel rendelkező Imp-α2 mutáns fehérje képes fizikailag kapcsolatba lépni az Imp-βKetel-lel. Az Imp-α2 fehérje zárt konformációját stabilizáló CASB domén hiányában, a nyitott konformációt biztosító Imp-α2CASB‾/Imp-βKetel komplexek továbbra is ki tudnak alakulni, és így továbbra is megkötik az NLS szekvenciával rendlekező mitotikus faktorokat, lehetővé téve az embrió normális fejlődését. A dolgozatomban leírt genetikai kölcsönhatások, melyeket egyrészről az imp α2D14 és imp-βKetRE34, másrészről az imp-α2NLSB‾ vagy imp-α2SNLSB‾és imp-βKetc02473 között figyeltünk meg, rávilágítanak arra, hogy az Imp-α2/Imp-βKetel funkcionális komplex mennyiségének egy kritikus küszöbérték felett kell maradni a korai embriógenezis osztódásai során. Míg az imp-βKet0 heterozigóta háttéren kifejeztetett imp α2NLSB‾ vagy imp α2SNLSB‾ allélok a funkcionális komplexek mennyiségét csökkentik, addig az imp-βKetRE34, ahogy az a pull down kísérletből és az interakciós mitotikus fenotípusokból kiderült, az NLS-fehérje/Imp-α2/Imp-βKetel hármas komplex stabilitásával teszi ugyanezt. Az imp-α2D14/imp-βKetRE34 és imp-α2D14/imp-βKetc02473; nos-Gal4-imp-α2NLSB‾ nőstények által rakott embriók immuno-citológiai vizsgálata szembetűnő osztódási rendellenességeket tárt fel. Mindkét mutáns csoport közös tulajdonsága, hogy az embriók fejlődése túlnyomórészt az első három-négy mitotikus ciklus során megállt és a többnyire metafázis-szerű orsók számában és alakjában is súlyos hibákat figyeltünk meg. Az embriók részletesebb konfokális mikroszkópos vizsgálatakor számtalan mitotikus hibát észleltünk. Korlátlan növekedésű szabad asztereket és túlnövekedett, jól fókuszált, vagy rendezetlen pólusú osztódási orsókat, orsó-fúziót és elvétve, keskeny orsókat láttunk. A robusztus méretű osztódási orsók gyakorta szabályos kromatin-eloszlással és -kondenzációval rendelkeztek. Ezzel szemben megfigyeltünk nem kondenzálódott DNS aggregátumokat, különösen a többpólusú- vagy a keskeny orsókban, amelyek csökkent mennyiségű kromatint tartalmaztak. Feltételezzük, hogy a túlnövekedett orsók és szabad aszterek, olyan mitotikus faktorok túlzott aktivitásának következményei, amelyek a MT-ok túlnövekedését idézik elő, mivel elégséges mennyiségű, funkcionális Imp-α2/Imp-βKetel komplex hiányában kikerülnek a citoplazmás gátlás alól. A sejtmaghártya rendellenes megszerveződését a hozzákapcsolódó lamin eloszlása rajzolta ki. Az imp-α2D14/imp-βKetRE34 és imp-α2D14/ imp-βKetc02473; nos-Gal4- imp α2NLSB‾nőstények embrióiban a lamin vezikulumok az orsó pólusokon, az asztrális MT-ok környezetében rendellenesen feldúsultak. A vad típusú muslica embrió részlegesen nyitott mitózisára jellemző, az osztódási orsókat széles sávban övező, orsóköpeny pedig hiányzott. A többpólusú orsókban gyakorta formálódott összefüggő maghártya a metafázisos lemezből az egyik pólusra kihúzott kromatidák körül. A mutáns anyák embrióiban a lamin aggregátumokat képzett, vagy gyakran a töredezett kromatin körül a normálisnál vastagabb és nagyobb gömböket formált. Érdekes módon, esetlegesen kromatin jelenléte nélkül is kialakult kisebb-nagyobb méretű összefüggő lamin struktúra, ami arra hívja fel a figyelmet, hogy az Imp-α2/Imp-βKetel komplex hibás kooperációja olyan faktorokat szabadít fel, amelyek kromatin nélkül is megformálják a maghártyát. A megfigyelt fenotípusok alapján feltételezzük, hogy a sejtmaghártya lebomlásának/újra-formálódásának mechanizmusában az Imp-α2/Imp-βKetel együttműködés fontos szerepet játszik és a lamin NLS-függő immunprecipitációja további bizonyíték erre a feltételezésre. A centroszomin festésekkel láthatóvá vált centroszóma rendellenességek arra világítottak rá, hogy az Imp-α2/Imp-βKetel szabályozás, az orsó kialakulásától függetlenül, érvényesül a centroszóma dinamikájában és a biogenezisében is. A mutáns anyák embrióiban az orsók többségén nincsen vagy csak egyetlen centroszóma van. Ennek oka feltehetően a centroszóma vesztés, amit az erőteljes asztrális mikrotubulus polimerizáció idéz elő. A ritkábban előforduló orsónkénti centroszóma-többlet, vagy a szabad centroszómák citoplazmás duplikációja, ugyanakkor azt jelzi, hogy a centroszóma és nukleáris osztódások szétkapcsolódtak a mutáns embriókban. Az imp α2D14/imp-βKetc02473; nos-Gal4-imp-α2NLSB‾ mutáns nőstények meg nem termékenyített petéiben de novo képződő centroszómák, felhívják a figyelmet az Imp α2/Imp-βKetel komplex egy új, esetleges szerepére, miszerint a komplex a centriólum biogenezis regulátorait is szabályozza. Eredményeinket összefoglalva elmondhatjuk, hogy az Imp-α2 és Imp-βKetel specifikus együttműködése szükséges a mitotikus orsók kialakulásának, a sejtmaghártya megszerveződésének, a centroszómák dinamikájának és a centriólumok biogenezisének a szabályozásához a Drosophila embrió korai sejtmagosztódásai során. A különböző mitotikus faktorok regulációja az Imp-α2 NLSB-doménjének közvetítésén keresztül érvényesül. A kísérleteink eredményei világosan rámutatnak az imp-α2 paralóg-specifikus, a másik két imp-α gén által nem helyettesíthető, szerepére a muslica embrió szinciciális osztódásai során.

Mű típusa: Disszertáció (Doktori értekezés)
Doktori iskola: Biológia Doktori Iskola
Tudományterület / tudományág: természettudományok > biológiai tudományok
Magyar cím: Az importin-α2 paralóg-specifikus szerepe és összehangolt együttműködése az importin-β/Ketel génnel az ecetmuslica korai embrionális fejlődésében
Idegen nyelvű cím: Paralog-Specific Cooperation between importin-α2 and importin-β/Ketel in Spindle Assembly during Drosophila Early Nuclear Divisions
Témavezető(k):
Témavezető neveBeosztás, tudományos fokozat, intézményEmail
Dr. Kiss Istvántudományos tanácsadó, az MTA doktora, MTA SZBK Biokémiai Intézetkiss.istvan@brc.mta.hu
EPrint azonosító (ID): 1786
Publikációban használt név : Viragh Erika
A mû MTMT azonosítója: 2889841
doi: 10.14232/phd.1786
A feltöltés ideje: 2013. ápr. 26. 09:42
Utolsó módosítás: 2015. máj. 06. 16:22
Egyebek (raktári szám): B 5537
URI: http://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/1786
Védés állapota: védett

Actions (login required)

Tétel nézet Tétel nézet

Letöltések

Letöltések havi bontásban az elmúlt egy évben