A Drosophila melanogaster Ref(2)P LC3- interakciós régió mutációjának hatása az oxidatív stresszre

	PDF (disszertáció) Download (4MB)
	PDF (tézisfüzet) Download (268kB)

Magyar nyelvű absztrakt

Az autofágia a sejtek evolúciósan konzervált intracelluláris degradációs folyamata. A fő útvonala során a citoplazmatikus anyag lebontása a lizoszómális rendszeren keresztül történik. A szelektív autofágia receptorok képesek felismerni az poliubiquitinálódott aggregátumokat és kötődni az Atg8/LC3 fehérjéhez, hogy biztosítsák az aggregátumok jelenlétét az autofagoszómába. A Drosophila-ban a legismertebb autofágia receptor, amihez az ubiquitinált fehérje aggregátumok kapcsolódnak az általunk is vizsgált p62/Ref(2)P. A Ref(2)P-ben található egy C-terminális ubiquitin-kötő domén (UBA), egy N-terminális PB1 domén, amely közvetíti az aggregátumok képződését és egy LIR (LC3- interakciós régió) motívum, egy strukturálatlan régióban, ami felel az LC3/Atg8a–val való kötődésért az autofág membránon. PhD munkám során a Ref(2)PLIR motívumában CRISPR/Cas9 közvetítette homológ rekombinációval létrehoztunk két aminosavcserét, ahol egy triptofánt és egy izoleucint alaninra cseréltünk. Így létrehoztunk egy Drosophila törzset, amely hordozza ezt a LIR mutációt, amely megszünteti a Ref(2)P-Atg8a kapcsolatát. Összefoglalásul elmondhatjuk, hogy sikeresen létrehoztunk egy Ref(2)PLIR mutáns törzset. Ezek az állatok nagy számban felhalmozzák a Ref(2)P-t és az ubiquitinált fehérjéket. Az általunk megfigyelt ubiquitin aggregátumok ubiquitinálódott Keap1-et tartalmaznak, amely az Nrf2 függő oxidatív stressz válasz negatív szabályozója. A Keap1 autofág lebontása a Ref(2)P LIR doménjén keresztül történik, így létrehozva az Atg8a-Ref(2)P-Keap1 komplexet, ami elősegíti a képződő aggregátumok degradálódását. Ezáltal az emlősökhöz hasonlóan a szabad Keap1 szint és az Nrf2 aktivitás a Ref(2)P által szabályozott. A Ref(2)P-Keap1 együttes szekvesztrálásának fontos következménye a LIR mutánsban a tartósan megnövekedett Nrf2 aktivitás, mivel annak proteaszómális lebomlását a mutáns Ref(2)P megakadályozza, ami végső soron megnövekedett PQ toleranciához vezet. Megfigyeltük, hogy a folyamatos Nrf2 aktivitás a Ref(2)PLIR mutáns állatokban fiziológiai előnyökkel jár a vad típushoz képest. A kísérleti adatainkból létrehozott modell szerint az ubiquitinálódott aggregátumok szekvesztrálódása először megemeli a proteotoxicitást. Azonban ezután az Nrf2 által vezérelt megnövekedett detoxifikáció csökkenti az oxidált, majd ubiquitinálódott fehérjék számát, amelyek oldható formában találhatóak és valószínűleg sokkal toxikusabbak. A szelektív ubiquitinált fehérje-autofágia hibás ecetmuslicák hasonló mennyiségű poliubiquitin aggregátumot halmoznak föl, mint az Atg mutánsok, de nem mutatnak jelentősebb fiziológiai hibákat.

Absztrakt (kivonat) idegen nyelven

Autophagy is an evolutionarily conserved intracellular degradation process of cellular self-eating and the major pathway for degradation of cytoplasmatic material by the lysosomal machinery. Selective autophagy receptors can recognize ubiquitinated aggregates, and bind to Atg8/LC3 proteins to ensure the capture of cargo into autophagosomes. In Drosophila, p62/Ref(2)P is the first autophagy receptor. P62 possesses a C-terminal ubiquitin-binding domain, an N-terminal PB1 domain to mediate aggregate formation, and a LIR (LC3-interacting region) motif in an unstructured region, which is responsible for LC3/Atg8a binding on autophagic membranes. The topic of my PhD work is to investigate the role of p62/Ref(2)P. We replaced two previously characterized key amino acids within the LIR motif: a Tryptophan and an Isoleucine were changed to Alanines by editing the endogenous gene using CRISPR. We generated Drosophila lines carrying this p62 LIR mutation, which disrupted the autophagic degradation of p62 and ubiquitinated cargo. To summarize, we generated a Ref(2)PLIR mutant stock. These flies accumulated copious amounts of Ref(2)P and poly-ubiquitin. We find that these polyUb aggregates contain ubiquitinated Keap1, a negative regulator of the Nrf2-dependent oxidative stress response. Keap1 autophagic degradation in flies is facilitated by Ref(2)P through its LIR-mediated interaction with the Atg8a-Keap1 complex, which promotes engulfment of the resulting aggregates. Thus, free Keap1 levels and by extension, Nrf2 activity is regulated by Ref(2)P similar to mammals. An important consequence of the Ref(2)P-Keap1 co-sequestration in the LIR mutant is persistently elevated Nrf2 activity as its proteasomal degradation is prevented, ultimately leading to increased PQ tolerance. We find that persistent Nrf2 activation in our Ref(2)PLIR mutants can have physiological benefits even compared to wild-type animals. In our model that is gleaned from the experimental results, sequestration of ubiquitinated cargoes firstly increases their proteotoxicity. However, subsequent Nrf2-mediated increased detoxification likely reduces the burden of ubiquitinated proteins, which may also reduce the levels of soluble, presumably more toxic species. Our selective ubiquitinated protein autophagy defective flies develop just as many poly-Ub aggregates as Atg mutants do, but they do not show any major physiological defects.

Tétel nézet