Mielinhüvely degradációt követő lipid törmelék eloszlás vizsgálata a központi idegrendszerben CARS mikroszkópiával és Agykérgi neurogliaform sejthálózat által kiváltott ionotróp és metabotróp gátló posztszinaptikus válaszok eltérő összegződése

Előnézet	PDF (disszertáció) Download (3MB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (646kB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (383kB) | Előnézet

Magyar nyelvű absztrakt

Doktori disszertációmban kettő egymástól független kutatási témával foglalkozok: 1. Az axonokat körül ölelő mielinhüvelyt érintő degenerációs elváltozások ismertek a sclerosis multiplex (SM), az egyik leggyakoribb idegrendszeri megbetegedés során. A kór kialakulási mechanizmusa ismeretlen. A klasszikus nézet szerint autoimmun eredetű megbetegedés. Ismert, hogy a betegség kialakulása után létrejött demielinizáció után a mielinhüvely bomlástermékei hozzájárulhatnak a folyamat krónikussá válásához. A betegség kialakulásával kapcsolatban azonban alternatív elméletek is léteznek, mivel egyes esetekben a betegség korai stádiumában a lézió megfigyelhető limfociták jelenléte nélkül is. Ennek alapján feltételezhető, hogy az oligodendrocita pusztulás az elsődleges probléma, mivel az elpusztult oligodendrocitákból származó mielintörmelék immunválaszt vált ki, amely a gyulladási folyamatokért felelős. Ezen elmélet alapján a mielintörmelék megjelenése és eloszlása a központi idegrendszerben fontos a későbbi gyulladási folyamatok kialakításában. Napjainkban azonban konkrét adatokkal nem rendelkezünk a mielintörmelék előfordulásáról. A demielinizációs folyamatokat vizsgáltuk agyszeleten, a lipid molekulákat megjelenítő koherens anti-Stokes Raman (CARS) mikroszkópiával. Cuprizonnal kiváltott oligodendrocita apoptózist és mielin degradációját vizsgáltuk egerekben. Kimutattuk, hogy a mielinizáltság csökkenése detektálható CARS módszerrel, mind a teljes jel intenzitáson mind az egyes rostokon kimutatható vastagság csökkenésén. A mielinizált agyterületeken a cuprizone kezelés hatására ~1 µm átmérőjű lipid partikulumok jelentek meg, mely a mielin pusztulása miatt visszamaradt lipid. Háromdimenziós rekonstrukciók segítségével e lipid maradványokat elsőként kvantifikáltuk, eloszlásukban agyterület függőséget találtunk. Kimutattuk, hogy a kezdeti stadiumban a demielinizációból keletkező lipid maradványok detektálhatók még a kimutatható mielin vastagság csökkenése előtt. Az SM etiologiaja és kialakulásának folyamata nem ismert. Eredményeink azt mutatják, hogy jelentős mennyiségű lipid törmelék képződik ami a károsodott fehérállomány térfogatának akár 2%-át is kiteheti, mely aztán hónapokig tárolódik és tovább halmozódik az idegszövetben. 2. Az agy működés megértésének szempontjából az, hogy hogyan dolgozzák fel az idegsejtek a bementi információt és alakítják kimenetté mindig is központi kérdés volt az agykutatásban. Az idegsejtekre több ezer gátló és serkentő szinaptikus bemenet érkezhet, ezeknek a bemeneteknek a változatos összegződése fogja meghatározni azt, hogy az idegsejt membránpotenciál értéke eléri-e a küszöbpotenciál értéket, hogy akcióspotenciál keletkezzen. Az agykérgi hálózatok működése során az ionotróp receptorok által összegződő posztszinaptikus válaszok törvényszerűségéről nagyszámú ismeretekkel rendelkezünk, azonban a metabotróp receptorok által közvetített posztszinaptikus válaszok integrációjáról eddigi ismereteink szerint nincs kísérletes adat. Az agykérgi gátló interneuronok közül a neurogliaform (NGF) sejt az egyetlen ismert idegsejt, amely képes hatékonyan aktiválni a posztszinaptikus metabotróp GABAB receptorokat, az ionotróp GABAA receptorok mellett. Munkámban karakterizáltuk az első rétegi NGF sejt és piramissejt közötti gátló kapcsolat kvantális paramétereit, amit anatómai vizsgálatokkal kombinálva meghatároztuk a térfogati jelátvitel lehetséges hatótávolságát. A teljes első rétegi neurogliaform sejtpopuláció anatómiai tulajdonságait szem előtt tartva modelleztük a populációszintű szinkron aktiváció esetében a lehetséges kimenetek arányát. A NGF sejtek szinkron aktivációját pedig in vivo Ca2+ képalkotó kísérleteket igazoltuk. Eredményeink alapján az agyszövet felső rétegének ~30%-ában legalább 2 konvergáló NGF bement van jelen. Elektrofiziológiai kísérleteket végeztük, ahol a kettő preszinaptikus NGF sejtről érkező IPSP integrációját vizsgáltuk 2/3 rétegi posztszinaptikus piramissejteken. Méréseink alapján az ionotróp GABAA jelek szublineárisan, a metabotróp GABAB jelek lineáris összegződtek. A GABAB jelek összegződését farmakológiai és komplex modellezési kísérletekkel vizsgáltuk, ami alapján azt tapasztaltuk, hogy a receptor-csatorna szubcelluláris kompozíciója meghatározó szerepet játszik a jelek összegződése szempontjából.

Absztrakt (kivonat) idegen nyelven

In my doctoral dissertation, I present two independent research topics: 1. Degradation of the myelin sheath is thought to be the cause of neurodegenerative diseases, such as multiple sclerosis (MS), but definitive agreement on the mechanism of how myelin is lost is currently lacking. Autoimmune initiation of MS has been recently questioned by proposing that the immune response is a consequence of oligodendrocyte degeneration. To study the process of myelin breakdown, we induced demyelination with cuprizone and applied coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, a non-destructive label-free method to image lipid structures in living tissue. We confirmed earlier results showing a brain region-dependent myelin destructive effect of cuprizone. In addition, high resolution in situ CARS imaging revealed myelin debris forming lipid droplets along with myelinated axon fibers. Quantification of lipid debris with custom-made software for segmentation and three-dimensional reconstruction revealed brain region-dependent accumulation of lipid drops inversely correlated with the thickness of myelin sheaths. Finally, we confirmed that in situ CARS imaging is applicable to living human brain tissue in brain slices derived from a patient. Thus, CARS microscopy is a potent tool for quantitative monitoring of myelin degradation in unprecedented spatiotemporal resolution during oligodendrocyte damage. We think that the accumulation of lipid drops around degrading myelin might be instrumental in triggering subsequent inflammatory processes. 2. The integration properties of synaptic inputs scattered over the neuronal surface are crucial to shaping the input-output characteristics of neurons. However, contrary to the summation of ionotropic receptor-mediated responses, experiments addressing the interaction of postsynaptic metabotropic signals arriving from multiple neuronal sources are scarce. Characterization of inhibitory connections established by individual layer 1 neurogliaform cells (NGFCs) revealed that NGFCs effectively activate postsynaptic GABA receptors in ~1.5um distance from the release site. This wide-spreading mode of inhibition and structural features combined with the NGFC network cooperation observed in vivo provide a contingency for converging outputs. Electrophysiological measurements of IPSPs arriving at the same postsynaptic neuron from two presynaptic NGFC showed that GABAA receptor-mediated responses summated sublinearly, while the interaction of GABAB receptor-mediated responses was linear. Next, We further investigated the possible influence of the receptor-channel complexes spatial distribution on the integration properties of inhibitory metabotropic receptor-mediated responses. Our results indicate that the spatial distribution itself has an effect on the integration properties: tight localization of the receptor-channel favors to the supralinear molecular interaction, while, segregated placement likely shifts the interaction towards sublinear.

Tétel nézet