Dimerization of the prion protein studied by site specific mutagenesis to p-benzoyl-L-phenylalanine

Sangeetham Sudheer Babu
Dimerization of the prion protein studied by site specific mutagenesis to p-benzoyl-L-phenylalanine.
[Thesis]

[thumbnail of SudheerBabuSangeetham_Ph.D_Dissertation.pdf]
Preview
PDF (disszertáció)
Download (4MB) | Preview
[thumbnail of SudheerBabuSangeetham_Ph.D_Booklet.pdf]
Preview
PDF (tézis)
Download (270kB) | Preview

Abstract in Hungarian

A fertőző szivacsos agysorvadás (angolul, Transmissible Spongiform Encephalopathy, TSE) betegségei, másnéven prionbetegségek, az ember- és állatokban egyaránt előforduló, halálos kimenetelű idegrendszeri betegségek azon csoportja, melyeket a sejtekben természetesen előforduló prion fehérje (PrPC) egy kóros konformációs állapotba (PrPSc) való átalakulása eredményez. Számos vizsgálat ellenére a PrPSc állapot kialakulási mechanizmusa és a folyamat során keletkező átmeneti fehérjekonformációs állapotok napjainkban még ismeretlenek. A prion fehérje dimer állapotának képződése kulcsfontosságú lépés lehet, és döntő szerepet játszhat a PrPC, PrPSc-vé való konformációs átmenetében. A humán prion betegségek egyik formája a kuru, amely a Pápua Új-Guineában élő fore törzsben kannibalizmus nyomán alakult ki, majd vált járvánnyá a huszadik század közepére. Későbbi vizsgálatok felfedték, hogy a törzs egy csoportja rezisztenciát szerzett a kuru betegséggel szemben. Genetikai elemzések később kimutatták, hogy a rezisztens egyének egy mutációval és így egy új prionfehérje-variánssal, a G127V-mutánssal rendelkeznek, amely heterozigóta állapotban és M129 allélú háttéren erős védelmet nyújt a betegséggel szemben. Transzgenikus egérvizsgálatok validálták az újonnan talált mutáció, G126V (az emberi G127V megfelelője egérben) protektív hatását, ráadásul, az egerek esetében, homozigóta állapotban is teljes ellenállást biztosított minden fajta prionbetegséggel szemben. A közelmúltban mag mágneses rezonancia (NMR) és molekuladinamikai (MD) vizsgálatok azt mutatták, hogy a G127V mutáció jelenléte gyengíti a polipeptid lánc által létrehozott hidrogén-kötéseket, és megakadályozza PrP dimerek és stabil fibrillumok képződését. Azonban, natív körülményekhez közelebb álló feltételek mellett, oldatban, ezt kísérletesen eddig nem igazolták. Valamint, arra vonatkozólag sem állnak adatok a rendelkezésünkre, hogy vajon ez-e a protektív hatás kifejtésének mechanizmusa in vivo körülmények között?. A jelen tanulmány egyik fő célkitűzése, a teljes szekvenciahosszúságú rekombináns egér prionfehérje (mPrP) dimerizációs felszínében résztvevő aminosavak feltérképezésére irányul. Ezt egy olyan módszer felhasználásával terveztük megvalósítani, amelyben genetikailag helyspecifikusan építünk egy fotoreaktív aminosavat, p-benzoil-L-fenilalanint (pBpa), a prion fehérje szekvenciájába, majd UV-fény alkalmazásával, keresztkötjük a segítségével az esetleges kölcsönhatásban résztvevő fehérje felületeket. A másik fő célkitűzésünk az volt, hogy kísérletileg teszteljük a G126V mutáció hatását az mPrP dimerképző képességére. Ezt két különböző megközelítés alkalmazásával céloztuk megvizsgálni. Elsőként, in vitro rendszerben, amelyben pBpa- és G126V mutációkat tartalmazó rekombináns mPrP fehérjéket önmagukban vagy fúziós fehérjeként C-terminálison egy mCherry fehérjével alkalmaztunk, és a hetero- valmaint homodimerek képződését vizsgáltuk UV besugárzás hatására képződött keresztkötés segítségével. Másodszor, egy emlős sejtkultúra modellrendszert alkalmaztunk, amelyben a prion dimerek képződését cisztein prion mutánsok tranziens expresszióján keresztül vizsgáltuk, amelyek képesek intermolekuláris diszulfidkötések létrehozására. Főbb eredményeink közé tartoznak az alábbiak. Létrehoztunk egy 44 DNS konstrukcióból álló fehérje-expressziós plazmid sorozatot melyek az mPrP vad típusú-, pBpa beépítésére alkalmas- és G126V-mutáns variánsait kódolják, önmagukban vagy C-terminálison mCherry fúziós fehérjével ellátva. A kódolt fehérjéket BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) törzsben sikeresen expresszáltuk, majd Ni-affinitás kromatográfiával tisztítottuk. Kiválasztott fehérjéken végzett MALDI-TOF tömegspektrometriás elemzés során igazoltuk, hogy a pBpa az expresszált fehérje populáció legalább ~ 90% -ában helyesen, a kívánt pozícióba épült be. Urea-gradiens elemzéssel kimutattuk, hogy a vad típusú és a pBpa-mutáns PrP-k konformációs stabilitása hasonló, azaz, a pBpa jelenléte nem befolyásolta azt. A létrehozott fehérjerendszert alkalmaztuk a fehérje dimerizációs felületének feltérképezésére: a különböző pozícióba épített pBpa-t tartalmazó prion fehérjék keresztkötése során, a PrP dimerizációját elősegítő körülmények között, azt tapasztaltuk, hogy jelentős mennyiségű dimer mutatható ki akkor amikor a fotoreaktív aminosav a prion hidrofób doménjének részét képezi, valamint, amikor az N-terminális flexibilis doménje bizonyos pozícióiban van jelen. A fúziós fehérje nélküli mPrP pBpa-variánsainak monomer- és keresztkötött dimer- állapotaiban felvett távoli-UV cirkuláris dikroikus (CD) spektruma megerősítette, hogy a fehérjék másodlagos szerkezeti elemeiben nincs jelentős eltérés, és hogy az mPrP helikális szerkezete megmaradt a dimerizáció során. Összefoglalva, módszerünkkel, tehát, kimutattuk, hogy a teljes hosszúságú prionfehérje hidrofób régiója és N-terminális doménje, elsősorban a 127- és 107-es pozíciók körüli régiók, az mPrP dimerizációs felületének szerves részét

Abstract in foreign language

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases, are a group of devastating neurological diseases of humans and animals caused by the conformational conversion of the normal cellular prion protein (PrPC) into an abnormal misfolded pathological form (PrPSc). Despite several investigations, the exact structure of PrPSc or of the intermediate forms and the mechanism leading to its formation, are not yet known. Formation of a dimeric PrP may be a crucial step and may play a key role in the conformational transition of PrPC to PrPSc. Kuru is one of the human TSEs, which originated as a result of cannibalistic rituals and became an epidemic in the Fore tribe of Papua New Guinea at the middle of the twentieth century. Studies found that a group of the tribe presented resistance to kuru. Subsequent genomic analysis studies reported that these individuals possessed a mutation encoding the novel prion protein variant, G127V, which appeared to provide strong protection against the disease in the heterozygous state and on an M129 allele background. Transgenic mice studies validated the protective effect of the newly found mutation, G126V (correspondent of the human G127V), moreover, in mice PrP(G126V) confers complete resistance to all kinds of prion diseases when in homozygous state. Recently, NMR and molecular dynamics studies indicated that the mutation G127V weakens the main-chain H-bond interactions and prevents the formation of dimers and stable fibrils of PrP. However, this has not yet been confirmed in more native conditions for the protein and it is not known whether this is the mechanism also in vivo or not?. As major aims in the presented studies, firstly, we set forward to investigate and identify the amino acid (aa.) positions present in the dimerization interface of the full length recombinant mouse prion protein (mPrP) by using site specific crosslinking with a genetically incorporated photoreactive amino acid, p-benzoyl-L-phenylalanine (pBpa). Secondly, our aim was to test the effect of G126V mutation on the dimer formation ability of mPrP experimentally, by using two different approaches. One is in an in vitro system employing recombinant mPrP proteins containing pBpa or G126V mutations in the sequence of prion protein, and untagged or C-terminally tagged by an mCherry, and using covalent crosslinking of the dimers by UV irradiation. Second is a mammalian cell culture based approach that follows the formation of prion dimers through expression of cysteine prion mutants, which are able to form intermolecular disulfide bonds. The most important results obtained during these studies are as follows. We created a set of 44 DNA constructs encoding wild type-, pBpa- and G126V-mutant variants of mPrP with and without an mCherry fusion tag, and expressed and purified the recombinant proteins using BL21(DE3) Escherichia coli (E. coli) bacteria for expression, followed by purification using Ni-NTA chromatography. Testing selected proteins, MALDI-TOF mass spectrometry analysis confirmed that the pBpa is correctly incorporated at the desired positionin in at least of ~90% of protein molecules expressed. Urea gradient assay revealed that conformational stabilities of wild type and of pBpa mutant PrP-s are similar in case of both untagged and tagged proteins, indicating that the presence of pBpa did not disturb the protein’s stabilities. We utilized the set of proteins created and the method established to investigate the dimerization interface of mPrP. Analysis of the photocrosslinked proteins in conditions favoring dimerization of PrP, indicate that pBpa-s at few positions that are part of the hydrophobic domain- and also few from N-terminal domain of PrP, yield significant amounts of crosslinked dimers.The far-UV CD spectra of the wild type and pBpa-variant monomers and of the crosslinked dimers of untagged mPrPs confirmed that upon dimer formation only slight variations in the secondary structural elements of the proteins occur, and that the predominantly helical structure of mPrP is preserved during dimerization. Taken together, we demonstrate here that beside the hydrophobic domain the N-terminal part of the prion protein, specifically the regions around position 127 and 107, is also integral part of the dimerization interface of the full length mPrP, and that the formed dimers are alpha helical. By applying the same method and selected pBpa-variants (at aa. positions 127, 128 and 131) and/or G126V mutant variants of mPrP (untagged and mCherry tagged), we studied the effect of the disease-protective mutation G127V (HuPrP), (corresponding to G126V in mPrP sequence), upon the dimerization ability of mPrP. By crosslinking studies, we found that wild type G126 mPrPs, are able to form both hetero- and homodimers when detected by pBpas at either 127th or 131th positions. However, when the G126V mutation is present in the sequence of mPrP, both hetero- and homodimerization significantly

Item Type: Thesis (Doktori értekezés)
Creators: Sangeetham Sudheer Babu
Subjects: 01. Natural sciences > 01.06. Biological sciences
01. Natural sciences > 01.06. Biological sciences > 01.06.03. Biochemistry and molecular biology
Divisions: Doctoral School of Multidisciplinary Medical Sciences
Tudományterület / tudományág: Medicine > Theoretical Medicine
Nyelv: English
Date: 2021. December 21.
Uncontrolled Keywords: Prion protein dimerization, prion diseases, G127V variant of prion protein, p-Benzoyl-L-Phenylalanine, photocrosslinking
Item ID: 11102
A mű MTMT azonosítója: 32868573
doi: https://doi.org/10.14232/phd.11102
Date Deposited: 2021. Dec. 03. 11:24
Last Modified: 2022. Jun. 08. 15:05
URI: https://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/11102
Defence/Citable status: Defended.

Actions (login required)

View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year