LINE-1 retrotransposons in cancer: Investigating human cervical carcinogenesis and developing an innovative transgenic mouse model for measuring somatic LINE-1 activity

Preview	PDF (thesis) Download (13MB) | Preview
Preview	PDF (booklet) Download (359kB) | Preview
Preview	PDF (booklet) Download (340kB) | Preview
Preview	PDF (related own publications) Download (11MB) | Preview

Abstract in Hungarian

A LINE-1 retrotranszpozonok az egyetlen ma is aktív transzpozábilis elemek az emberi genomban. Az ORF1 és ORF2 fehérjéket kódolják, melyek elengedhetetlenek a „másolás és beillesztés” típusú replikációs mechanizmusukhoz. A LINE-1 szekvenciák az emberi genom 17%-át alkotják, körülbelül 500 000 kópiával, amelyek közül 100-150 retrotranszpozícióra képes elem. A LINE-1 aktivitás hozzájárul a genom evolúciójához, többek között de novo integrációk, génduplikációk, exon shuffling és alternatív splicing elősegítésével. Korábban úgy vélték, hogy a LINE-1 aktivitás csak a csíravonal sejtekre korlátozódik. ORF1p immunhisztokémiai vizsgálatok azonban kimutatták, hogy a karcinómákban kifejezett LINE-1 expresszió figyelhető meg, míg az egészséges szövetekből gyakorlatilag hiányzik. Új generációs szekvenálási adatok igazolták, hogy a szomatikus LINE-1 retrotranszpozíció a legtöbb ráktípusban jelen van, és gyakorisága összhangban van az ORF1p pozitivitási arányokkal. A LINE-1 szerepének mélyebb megértése érdekében 143 FFPE méhnyakminta ORF1p expresszióját elemeztük immunhisztokémiával, összevetve azt a Ki67 és p16 markerek expressziójával. 112 diszpláziás és daganatos mintából 110 immunpozitív volt, míg 24 normál minta közül 19 nem mutatott ORF1p expressziót. Az ORF1p expressziója progresszíven növekedett a cervikális intraepiteliális neoplázia (CIN) súlyossági stádiumok előrehaladtával: CIN I esetében az alsó cervikális hámrétegekben, CIN II esetében az alsó kétharmadban, míg CIN III és invazív rák esetén teljes vastagságban kifejeződött, valamint az immunreakció intenzitása is progresszív növekedést mutatott. Ez megerősíti az ORF1p mint korai diagnosztikus marker hasznosíthatóságát a méhnyak rákelőző állapotainak vizsgálatában. A LINE-1 nemcsak a fajok evolúciójában játszott szerepet, hanem tumorok fejlődését is elősegítheti onkogén mutációk indukálásával. A szomatikus sejtek védekező mechanizmusokat alkalmaznak a LINE-1 aktivitásának gátlására. Azonban epigenetikai dereguláció, környezeti expozíciók és egyéb ismeretlen faktorok károsíthatják ezeket a mechanizmusokat, lehetővé téve a LINE-1 aktivációját és a tumorfejlődést. A szomatikus LINE-1 aktivitást befolyásoló hatások vizsgálatának érdekében kifejlesztettünk egy in vivo egérmodellt, amely lehetővé teszi a szomatikus LINE-1 retrotranszpozíció vizsgálatát. Az ORFeus riporter rendszer egy szintetikus LINE-1 konstrukció, amely egy EGFP kazettát tartalmaz, kifejezetten a LINE-1 retrotranszpozíciós ráta mérésére. A riport nem autonóm változatát alkalmaztuk, ahol az ORF1p-et a konstrukció kódolja, míg az ORF2p endogén módon termelődik a sejtekben. Ha a retrotranszpozíció sikeres, az EGFP expressziója aktiválódik, amely az érintett sejt összes utódjában jelen lesz. Emiatt a csíravonal transzgénikus modellek technikai korlátokba ütköznek, hiszen azok az embrió fejlődésének korai szakaszában bekövetkező retrotranszpozíció miatt nem használhatóak, mivel az érintett utódsejtek mindegyike GFP-pozitívvá válna. Ennek elkerülésére egy szomatikus transzgenezis alapú módszert alkottunk meg. A LINE-1 riportert I. típusú tirozinémiában szenvedő (Fah-deficiens) egerek májába juttattuk be úgy, hogy a májregenerációt kihasználva egy olyan transzgénikus szervet hoztunk létre, amely egyszerre expresszálja a LINE-1-et és a Fah terápiás gént. A Sleeping Beauty transzpozon rendszer segítségével stabilan integráltuk a LINE-1 ORFeus riportert a hepatociták genomjába, majd különböző vegyületekkel kezeltük az állatokat. A szomatikusan transzgénikus egérmodell kifejlesztésével lehetővé vált a szomatikus LINE-1 aktivitás pontos mérése in vivo, amely jelentős előrelépés a retrotranszpozíció környezeti tényezőktől való függésének vizsgálatában. A LINE-1 aktivitás változásait különböző vegyi anyagokkal történő expozícióval teszteltük. A Decitabine, egy DNS hipometiláló szer, és a FICZ, egy mikrobiom által termelt triptofán-metabolit, jelentősen növelte a LINE-1 riporter aktivációját. Eredményeink validálják az in vivo platformot, amely lehetővé teszi a vegyi anyagok genotoxikus hatásainak értékelését, potenciálisan feltárva korábban nem ismert rákkeltő tényezőket. Ez a megközelítés hozzájárulhat a rák kialakulásának "fekete dobozának" jobb megértéséhez, segítve az ismeretlen eredetű tumorok kockázati tényezőinek azonosítását.

Abstract in foreign language

LINE-1 retrotransposons are the only active transposable elements in the human genome, encoding ORF1 and ORF2 proteins essential for their “copy-and-paste” propagation. These elements entered mammalian genomes ~70 million years ago, co-evolving with species and now constituting 17% of the human genome, with 500,000 copies, of which 100-150 are retrotransposition-competent. LINE-1 contributes to genomic evolution by promoting gene duplications, exon shuffling, and alternative splicing. Previously, LINE-1 activity was believed to be restricted to the germline. However, immunostaining for ORF1p has shown high LINE-1 expression in carcinomas, while normal tissues exhibit virtually zero LINE-1 activity. Next-generation sequencing confirmed somatic LINE-1 retrotransposition in multiple cancers, with frequencies matching ORF1p positivity rates. To further investigate its role in cervical carcinogenesis, we analyzed 143 FFPE human cervical specimens, evaluating ORF1p expression against Ki67 and p16 markers. ORF1p was detected in 110 out of 112 neoplastic and dysplastic specimens, whereas 19 of 24 normal cervical samples lacked expression. ORF1p expression progressively increased with advancing CIN (cervical intraepithelial neoplasia) grades: in CIN I, it was limited to the lower epithelial layers, in CIN II, it expanded to the lower two-thirds, and in CIN III and invasive cancer, it showed full-thickness expression. These findings position ORF1p as a promising early diagnostic marker for cervical neoplasia. LINE-1 not only shaped species evolution but also contributes to tumor evolution by inducing driver mutations. To counteract these effects, somatic cells employ mechanisms to suppress LINE-1 activity. However, epigenetic deregulation, environmental exposures, and oncogenic transformations can compromise these defenses, leading to LINE-1 activation and tumor evolution. To better understand these mechanisms, we developed an in vivo model to study somatic LINE-1 retrotransposition. The ORFeus reporter system is a synthetic LINE-1 construct linked to an EGFP cassette, specifically designed to measure LINE-1 retrotransposition frequency. We used a non-autonomous ORFeus variant, where ORF1p is encoded within the construct, while ORF2p is supplied endogenously by the host cell. Successful retrotransposition results in EGFP expression, which is inherited by all progeny of the affected cell. We aimed to overcome previous technical limitations of germline transgenic models. Conventional germline transgenesis is unsuitable due to early embryonic retrotransposition, which results in permanent GFP positivity in all progeny cells. To circumvent this, we introduced the LINE-1 reporter in the liver of Fah-deficient mice, leveraging liver regeneration to create a transgenic organ expressing LINE-1 alongside the Fah therapeutic gene. Using the Sleeping Beauty transposon system, we stably integrated the ORFeus LINE-1 reporter into hepatocytes and monitored LINE-1 activity after exposure to specific chemicals. While tumor-derived cell lines could theoretically be used to study somatic LINE-1 activity, these cells often have compromised LINE-1 defense mechanisms, making them unreliable for in vivo extrapolation. By developing a somatic transgenic mouse model, we enabled accurate, in vivo measurement of LINE-1 activity, a breakthrough in the study of somatic retrotransposition. We tested LINE-1 activation using specific chemical exposures. Decitabine, a DNA hypomethylating agent, and FICZ, a microbiome-derived tryptophan metabolite, both increased LINE-1 reporter activation, demonstrating the potential for environmental factors to induce LINE-1 retrotransposition. Our findings validate this in vivo platform as a novel tool for assessing the genotoxic impact of environmental chemicals, potentially revealing previously unrecognized carcinogenic factors. This approach could shed light on the "black box" of cancer etiology, identifying new risk factors for cancers with unclear origins.

View Item