Az importin-α2 paralóg-specifikus szerepe és összehangolt együttműködése az importin-β/Ketel génnel az ecetmuslica korai embrionális fejlődésében

Előnézet	PDF (disszertáció) Download (29MB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (413kB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (357kB) | Előnézet

Magyar nyelvű absztrakt

ÖSSZEFOGLALÓ A Ran szabályozása mellett az importinok végzik a makromolekulák aktív szállítását a sejtmagi transzport folyamatokban. A citoplazmában kialakult hármas komplexben az Imp-α közvetíti az NLS szekvenciával rendelkező célfehérjék és az Imp β közötti kapcsolatot. Az utóbbi évek kutatásai alapján körvonalazódott, hogy az Imp-α/Imp-β a sejtosztódási folyamatok térbeli- és időbeli koordinálásában is részt vesz, mégpedig az osztódási orsót megszervező SAF és MAP fehérjék aktivitásának szabályozásán keresztül. Az ecetmuslica egy imp-β és három imp-α génnel rendelkezik. Az imp-β és imp-α3 főként a sejtmagi transzportban, míg az imp-α1 a spermatogenezisben lát el specifikus feladatot. Ugyanakkor, az imp-α gének szerepét a Drosophila embrió korai osztódásai során eddig még nem vizsgálták. Korábban, laboratóriumunkban P elem mutagenezis során azonosítottuk az imp α2 gén Drosophila ortológját, és részletes vizsgálatával felderítettük a muslica petefejlődésében betöltött speciális szerepét (Gorjánácz et al., 2002; Török et al., 1995). A homozigóta imp-α2D14 null mutánsok felnőtt egyeddé fejlődnek, viszont a nőstények 100%-ban sterilek, többségük egyáltalán nem is rak petét. A nagyon ritkán mégis kialakuló peték súlyos fejlődési rendellenességet mutatnak, amelynek oka a gyűrűcsatornák beszűkülése a petefejlődés során. Ezt a hibát sem az imp-α1, sem az imp α3 nem tudta menekíteni. Az imp-α2 kis NLS-kötő régióját érintő, illetve az Imp-β kötésért felelős, IBB doménjét kiejtő mutáns transzgének kifejeztetése normális morfológiájú, érett petét eredményez, viszont a lerakott petékből nem fejlődnek embriók (Gorjánácz et al., 2006). Ez az eredmény felvetette annak lehetőségét, hogy az importinok mitózisban, és azon belül az osztódási orsó kialakulásában betöltött szerepét in vivo vizsgáljuk meg Drosophila melanogaster-ben. Dolgozatomban az imp-α2 korai embrionális funkcióit mutatom be, az imp-β-val létrejött genetikai interakcióján keresztül, illetve, sejtbiológiai és biokémiai módszerek segítségével. Munkánk az imp-α2 gén és az imp-β Drosophila ortológja, az imp-βKetel gén közötti genetikai kölcsönhatás vizsgálatával kezdődött. Az imp-α2 gén imp-α2D14-es null allélje, és hat recesszív imp-βKetel allél (imp-βKetRP13, imp-βKetRX13 és imp-βKetRE34 – a domináns nősténysteril imp-βKetD revertánsai –, illetve imp-βKetc02473, imp-βKete02657 és imp-βKete03750 – piggyBac inszerciók) különböző kombinációit hordozó, transzheterozigóta anyáktól származó embriók fejlődését követtük nyomon. A fenti kombinációk közül egyedül az imp-α2D14/imp-βKetRE34 eredményezett embrióletalitást, amelyet mind az imp-α2, mind az imp-βKetel vad alléljeinek transzgénikus kifejeztetése egyaránt menekített, jelezvén, hogy az Imp α2 és Imp βKetel fehérjék koordinált együttműködése kritikus a muslica korai embrionális fejlődésében. Az imp-βKetRE34 allélban azonosítottunk egy második mutációt, a D725N helyettesítést, amely az Imp-βKetel Imp-α2-kötő doménjében található. Az Imp-βKetel fehérje in silico és biokémiai módszerekkel történő vizsgálata szerint az Imp-βKetRE34 és a vad Imp βKetel fehérje az Imp-α2 IBB doménjét ugyanolyan erősen köti. Ugyanakkor, az N725 aminosav olyan, új, molekulán belüli, szerkezetmódosító kötéseket alakít ki, amelyek feltehetően javítanak az Imp-βKetD rendellenesen nyitott konformációján, ezáltal csökkentve a domináns nősténysteril Imp-βKetD fehérje mérgező hatását. A Imp βKetRE34 szerkezeti módosulása ugyanakkor, nem állítja vissza teljesen a vad típusú Imp βKetel molekulára jellemző fehérje kötési flexibilitást, amint arra a RanGTP és RanGDP fehérjékhez történő megemelkedett kötési hajlandósága is rávilágít. Feltehetően ez az oka az imp-βKetRE34 szemi-domináns természetének. Ezt a feltételezésünket támasztja alá, hogy a RanGTP szintjének csökkentése (a Bj1/RCCI funkcióvesztéses mutációja révén) szuppresszálta, míg annak növelése (RanGap funkcióvesztéses mutációk által), erősítette az imp-βKetRE34 antimorf fenotípusát. imp-α2, imp-α1 és imp-α3 klasszikus funkcióvesztéses allélok imp βKetRE34-el transzheterozigóta kombinációja esetén, vagy mindhárom imp-α paralóg imp βKetRE34 háttéren történő, ovárium-specifikus RNS csendesítésekor, csak az Imp α2 szintjének csökkentése okozott embrióletalitást. Továbbá, az imp-α2D14/imp-βKetRE34 allélkombináció erős embrióletális fenotípusát, az azonos szinten és mintázatban kifejeztetett, UTRΔimp-α transzgének közül, kizárólag az UTRΔimp-α2 menekítette. Az Imp-α2 magas koncentrációban van jelen a 0-2 órás embrió szinciciális plazmájában. A gyors osztódási ciklusok során a mitotikus orsó mikrotubulusiahoz kötődik, míg interfázisban a sejtmagban határozottan feldúsul. A genetikai analízisek eredményeivel párosulva ez a sejtciklus-függő eloszlási mintázat egyértelműen rávilágít a muslica imp α2 génjének paralóg-specifikus szerepére az embrió korai fejlődési szakaszában a szinkron magosztódások során...

Tétel nézet