A Drosophila melanogaster p53 sumoilációjának molekuláris biológiai és genetikai vizsgálata

Pardi Norbert
A Drosophila melanogaster p53 sumoilációjának molekuláris biológiai és genetikai vizsgálata.
[Thesis] (Unpublished)

[img]
Preview
PDF (disszertáció)
Download (2MB)
[img]
Preview
PDF (tézis)
Download (191kB)
[img]
Preview
PDF (tézis)
Download (119kB)

Abstract in Hungarian

A p53 egyike a legismertebb tumor szupresszoroknak. Számos ráktípusban (vastagbél, tüdő, emlő, nyelőcső, máj, húgyhólyag, petefészek, agy) ezen gén mutációját is kimutatták. Az is nagyon gyakori, hogy nem a p53-ban bekövetkező mutáció vezet tumorok kialakulásához, hanem a p53 aktiválódási útvonalában történik hiba. Az aktiválódott p53 képes gátolni a sejtciklust, vagy apoptózist tud előidézni, és fontos szerepet játszik a sejtdifferenciálódás indukciójában is. Kimutatták, hogy a vad típusú p53 gátolja az érképződést tumorokban az új véredények képzésében részt vevő gének szabályzásával. A p53 sejtciklus gátló funkciója a fehérje transzkripciós faktorként történő működésén keresztül valósul meg. A p53 számos apoptotikus gén transzkripciós aktiválására is képes. Az ezredfordulón azonosították a p53 tumor szupresszor Drosophila melanogaster ortológját. A humán és az ecetmuslica fehérje számos hasonló funkcióval rendelkezik, tehát úgy tűnik, hogy a p53-mal kapcsolatos jelátviteli útvonalak - legalább részben - konzerváltak. Mivel a p53 egy nagyon fontos fehérje, minden róla kapott információ érdekes lehet. A rendelkezésünkre álló ecetmuslica - mint soksejtű modellorganizmus - kiváló lehetőséget teremt a fehérje részletes biokémiai és genetikai vizsgálatához. Munkám kezdeti szakaszában Dmp53 kölcsönható fehérjéket azonosítottam Drosophila embrionális cDNS könyvtáron végrehajtott nagyléptékű szűréssel. Ezek közt Dmp53-mal interakcióba lépő fehérjeként azonosítottam a sumoilációban szerepet játszó enzimeket is. Dolgozatomban a Dmp53 SUMO-módosításával kapcsolatos kérdésekre keresem a választ. Élesztő két-hibrid módszer segítségével kimutattam, hogy a Dmp53 C-terminális doménje vesz részt a sumoilációban szerepet játszó fehérjékkel kialakított kölcsönhatásban. A Dmp53 szekvenciájában egy olyan helyet találtam, amely tökéletesen megfelel a konszenzus sumoilációs szekvenciának. Ennek a helynek a megváltoztatása nem befolyásolja a vizsgált kölcsönhatásokat, és a fehérje továbbra is kötődik a sumoilációs enzimekhez. Megvizsgáltam, hogy a Dmp53 és a SUMO módosításban részt vevő fehérjéket kódoló gének között genetikai kölcsönhatást ki tudok-e mutatni. Azt az eredményt kaptam, hogy a sumoiláció hiánya, vagy csökkent mértékű megvalósulása csökkenti a Dmp53 DNS károsodások kijavítását biztosító aktivitását. A Dmp53 további in vivo vizsgálatához transzgenikus állatokat hoztam létre.Vizsgálataim során azt szerettem volna megtudni, hogy a fehérjét túltermelve látok-e fenotípus különbséget a vad típusú, illetve mutáns Dmp53-at expresszáló állatok között. Akár a 2., akár a 3. kromoszómás mutáns Dmp53-at termelő törzset használtam, súlyosabb fenotípusokat kaptam, mint a vad típusú fehérjét expresszáló törzsnél. Továbbhaladva, Western analízissel ellenőriztem transzgenikus muslicáinkban a Dmp53 mennyiségét. Azt tapasztaltam, hogy a pontmutáns fehérjét túltermelő random inszertálódott transzgént tartalmazó állatokban a fehérje stabilizálódik, és nagy mennyiségben van jelen, sokkal több van belőle, mint a vad típusút expresszáló társaikban. Ugyanezen mintákból megpróbáltam a Dmp53 SUMO-módosított formáját is kimutatni, de nem jártam sikerrel. A sumoiláció kimutatásának általánosan használt módszere annak transzfektált sejtekben történő detektálása. Ezért megpróbáltam a SUMO-módosítás S2 sejtekben történő kimutatását. Bár a fehérjét sikerült túltermelni - SUMO-módosított Dmp53 frakciót nem tudtam detektálni. A sumoiláció számos jól jellemzett biológia funkcióval rendelkezik. Ismert, hogy bizonyos fehérjék sumoilált, illetve módosítatlan formája különböző sejten belüli elhelyezkedést mutat, tehát a sumoiláció/desumoiláció szükséges a fehérje citoplazma és sejtmag közötti transzportjához. Immunfestést alkalmazva Drosophila szöveteken azt tapasztaltam,hogy a Dmp53 fehérje vad típusú, illetve mutáns formája is, a sejtmagban helyezkedik el, ami azt mutatja, hogy a fehérje transzportját a SUMO-módosítás nem, vagy nem önmagában befolyásolja. A sumoiláció egyik jól ismert hatása, hogy a célfehérje transzkripciós aktivitását képes módosítani. Kísérleteimben nem találtam lényeges különbséget a vad típusú és mutáns fehérje transzkripcióra kifejtett hatásában.

Item Type: Thesis (PhD)
Creators: Pardi Norbert
Title of the thesis in foreign language: Molecular biological and genetic study of the sumoylation of Drosophila melanogaster p53
Divisions: Doctoral School of Biology
Discipline label: Natural Sciences > Biology
Defence date label: 2011. April 19.
Item ID: 694
MTMT id: 2774813
doi: https://doi.org/10.14232/phd.694
Date Deposited: 2011. Mar. 01. 09:17
Last Modified: 2019. Jul. 15. 14:49
Depository no.: B 4857
URI: http://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/694
Defence/Citable status: Defended.

Actions (login required)

View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year