Ionotropic glutamate antagonism in the 4-aminopyridine rat convulsion model: the morphological and functional aspects of the acute seizure

Dr. Weiczner Roland
Ionotropic glutamate antagonism in the 4-aminopyridine rat convulsion model: the morphological and functional aspects of the acute seizure.
Doktori értekezés, Szegedi Tudományegyetem.
(2009)

[img]
Előnézet
PDF (disszertáció)
Download (2MB)
[img]
Előnézet
PDF (tézis)
Download (366kB)

Magyar nyelvű absztrakt

1. BEVEZETÉS Az idegsejt-tevékenység kóros mértékűen fokozott szinkronizációja, valamint a serkentő és gátló tényezők közti egyensúlyzavar tekinthető a központi idegrendszeri görcstevékenység kórélettani alapjának. Míg a hagyományos terápiás protokollok a gátló neurotranszmisszió megerősítésére fókuszálnak, az excitátoros válaszok gátlása kurrens kutatások tárgya, bár az eredmények jelentős része az NMDA-receptorok közvetítette jelenségekre korlátozódik. A K+-csatorna-blokkoló 4-aminopriridin (4-AP) generalizált tónusos-klónusos görcstevé-kenységgel (GTCS) együtt járó konvulziók kiváltására alkalmas vegyület in vivo állatmodellben. A fenntartott, ismétlődő, szinkronizált idegsejt-kisülés, az ún. “burst firing” alapjelensége a központi idegrendszeri konvulzióknak. Az elhúzódó neuronális depolarizáció elősegíti mind a gátló, mind a serkentő neurotranszmitterek felszabadulását, kiváltképp a glutamátét (GLU). Az azonnali korai gének (IEG) közé tartozó c-fos egy indukálható transzkripciós faktor, amely fontos szerepet játszik számos sejtmagi regulációs folyamatban. A c-fos mRNS transzkripció szoros korrelációt mutat az elektrofiziológiailag igazolt sejtaktivitással, ezáltal a sejtmagban megjelenő Fos protein a fokozott neuronális aktivitás szenzitív markerének tekinthető. Többek között az NMDA- és AMPA-receptorok közvetítette jelátviteli folyamatok indukálják a c-fos transzkripciót. Az astrocyták perikapilláris végtalpainak duzzadása a görcstevékenység egyik legkorábbi megfigyelhető neuropatológiai elváltozása. A görcstevékenység farmakológiai gátlása csökkenti az agyödémát számos kísérletes modellben. A nagy affinitású nyitott csatorna blokkoló NMDA-receptor antagonista MK-801 (dizocilpin maleát) potens antikonvulzív vegyület, neuroprotektív a görcstevékenységhez társuló károsodásokkal szemben. A GYKI 52466 egy szelektív, nem-kompetitív, valószínűleg alloszterikus antagonistája az AMPA-altípusú ionotróp glutamát-receptoroknak, igazolt antikonvulzív, antinociceptív, neuroprotektív hatásokkal. Az agykéreg és a hippocampus szinapszisai általában NMDA- és AMPA-receptorokat egyaránt tartalmaznak. Korábbi vizsgálataink szerint a 4-AP akut konvulziós modellben előkezelésként alkalmazott NMDA-receptor antagonisták szignifikánsan csökkentették a c-fos expressziót a vizsgált neo- és allocorticalis területeken, valamint szignifikánsan csökkentették a GTCS megjelenési arányát vagy megnövelték kialakulásának látenciáját. 2. CÉLKITŰZÉSEK A. Veronai kooperációs partnereink előzetes tapasztalataira alapozva, olyan tanulmányt terveztünk, amely fMRI segítségével írja le a 4-AP-modellt, különös tekintettel a regionális agyi vérátáramlásra (rCBF) és a víztereket jellemző látszólagos diffúziós együtthatóra (ADC). B. Az AMPA-receptor antagonizmus célja az volt, hogy leírjuk a GYKI 52466 hatását a 4-AP modellben, valamint a parvalbumin-pozitív gátló sejtpopuláció aktivációjában bekövetkezett változásokat megfigyeljük. C. Az NMDA-antagonista MK-801 szignifikánsan csökkentette a görcstevékenységhez társuló astrocyta-duzzadást az agykéregben, így összehasonlíthatjuk az NMDA- és az AMPA-receptor antagonizmus hatását a perikapilláris ödémára és a neuronális aktivációra. 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Az MRI kísérleteket a Veronai Tudományegyetem MRI Laborjában végeztük. 12 hím Wistar patkányon 5 mg/kg 4-AP intraperitonealis (i.p.) beadásával konvulziót indukáltunk, míg az azonos létszámú kontroll állatcsoport a 4-AP oldószerét kapta. Az MRI felvételeket 2, 24 órával illetve 3 nappal a görcstevékenység leállítása után végeztük. Az állatokon strukturális (T2-súlyozott, továbbiakban T2W; és diffúzió-súlyozott, továbbiakban DWI felvételek) és funkcionális (regionális agyi vérátáramlás, rCBV) MRI vizsgálatokat végeztünk, eredményeinket statisztikai analízis alá vetettük (a 4-AP-kezelt és kontroll állatok eredményeinek összehasonlítása). Az antagonista-előkezeléseket az SZTE ÁOK Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézetében, hím Wistar patkányokon végeztük. A kezelt állatcsoport a nem-kompetitív NMDA-receptor antagonista MK801 (18 állat, 1 mg/kg, i.p.) illetve a nem-kompetitiív AMPA-receptor antagonista GYKI 52466 (10-10 állat, 25 ill. 50 mg/kg i.p.) előkezelés után 10 ill. 15 perccel 4-AP injekciót kapott (5 mg/kg, i.p.) A kontroll állatok (18 illetve 10 állat) az antagonisták oldószereinek megfelelő térfogatait és görcskeltő 4-AP-t kaptak. A kísérletek végén (1, 3 ill.24 órával a görcskeltés után) az MK801-csoport állatainak és kontrolljainak parietalis neocortexből származó mintáit elektronmikroszkópos vizsgálatra dolgoztuk fel. A GYKI 52466-csoport előkezelt és kontroll állatait 1 órával a görcskeltés után c-fos és parvalbumin immunhisztokémiára illetve elektronmikroszkópiára (parietalis neocortex és hippocampus) dolgoztuk fel. A görcskísérletek során mértük a GTCS kialakulásának látenciáját, figyeltük előfordulását és a kísérleti állatok mortalitását. Adatainkat (immunhisztokémia: c-fos, c-fos és parvalbumin pozitív sejtek száma, EM: gliatalp-duzzadás, kapilláris-terület, viselkedés-vizsgálatok: GTCS előfordulása, látenciája, mortalitása) statisztikai analízis alá vetettük (kontroll és előkezelt csoportok összevetése). 4. EREDMÉNYEK A strukturális MRI T2W felvételein szignifikáns jelintenzitás-növekedés látható a parietalis ill. temporalis neocortexben, a medialis thalamusban és a hippocampusban, a T2W képek 24 óra múlva is emelkedett értékeket mutattak. 3 nap elteltével nem volt értékelhető különbség a kezelt és a kontroll állatok között. A DWI-felvételeken konzisztens változásokat tapasztaltunk a látszólagos diffúziós együttható (ADC) értékeiben a parietalis neocortexben, hippocampusban és amygdalában 2 és 24 óra elteltével, a kontrollokkal összevetve. Az átlagos ADC-érték csökkent a parietalis, temporalis neocortexben, a hippocampusban és a medialis thalamusban 2 órával a 4-AP görcsök után, további csökkenés volt detektálható 24 óra után, de az ADC értékek visszatértek az alapszintre 3 nap elteltével. Míg 2 órával a konvulziók után szignifikánsan magasabbak voltak, ugyanakkor 24 órával a konvulziók után a rCBF értékek minimális eltérést mutattak a kontroll értékektől a parietalis neocortexben és a hippocampusban, de szignifikánsan emelkedettek maradtak a medialis thalamusban. 3 nap elteltével nem volt szignifikáns eltérés kimutatható. A 4-AP i.p. alkalmazása jellegzetes viselkedésbeli eltéréseket okoz, a bevezető tünetek után kialakul a generalizált tónusos-klónusos görcstevékenység. A kísérleti állatok megközelítőleg 20%-a pusztul el a konvulziók közben. A GYKI 52466 hatására a GTCS látenciák szignifikánsan növekedtek a kontrollal összevetve, bár az eltérő dózisok között nem volt hatásbeli különbség. A GTCS a kezelési csoportok 20 (25 mg/kg) ill. 10%-ában (50 mg/kg); míg a kontroll csoport egyedeinek 80%-ban fordult elő. Az előkezelt csoportok egyedeinek túlélése 100%-os, míg a kontroll csoporté 80%-os volt. A GYKI 52466 mellékhatásaként átmeneti ataxia, mozgáskoordinációs zavar, csökkent mozgási tevékenység és szedatív hatás volt átmenetileg megfigyelhető. Míg az alacsonyabb dózisú GYKI 52466 szignifikánsan megemelte, addig a magasabb dózisú GYKI 52466 szignifikánsan csökkentette a c-fos-IR (immunreaktív) sejtek számát a neocortexben, a csökkenés a II-III és V-VI laminákban volt szignifikáns. A c-fos és parvalbumin kettősen pozitív sejtek esetében az alacsonyabb dózis nem okozott statisztikailag jelentős eltérést, míg a magasabb dózisú előkezelés szignifikánsan csökkentette a kettősen festődő sejtek számát. A CA1-3 hippocampalis areákban és a gyrus dentatus hilusában az alacsonyabb dózisú GYKI 52466 előkezelés is eredményesen csökkentette a c-fos-IR sejtmagok, ill. a kettősen pozitív sejtek számát; a c-fos-IR sejtmagok számában bekövetkezett változás még kifejezettebb a gyrus dentatus granularis rétegében. A MK-801 előkezelés szignifikánsan csökkentette a perikapilláris astrocyta végtalpak duzzadását a 4-AP-kontrollokkal összehasonlítva, minden vizsgált időpontban. A kapilláris területek nem mutattak szignifikáns különbséget aMK-801 előkezelt és előkezelésben nem részesült az 1 és 24 órás csoportok esetében, míg a 3 órás csoportban a kapilláris lumen kompressziója volt megfigyelhető a perikapilláris ödéma miatt. A GYKI 52466 előkezelés nem befolyásolta a neocorticalis kapilláris területek nagyságát, míg az alacsonyabb dózisú előkezelés szignifikánsan növelte, a magasabb dózisú nem befolyásolta a perikapilláris astrocyta duzzadást. A hippocampusban az alacsonyabb dózisú előkezelés esetében szignifikáns csökkenés következett be, míg a magasabb dózis esetében nem volt ilyen eltérés a kontroll csoporttal összevetve. 5. MEGBESZÉLÉS A krónikus epilepszia-modellekkel összehasonlítva a rövid, akut görcsök által okozott T2W eltérések a konvulziók után 2 órával jelennek meg, míg a krónikus esetben a csúcs 24 óra elteltével jelentkezik, amikor az akut modell emelkedett értékei már lecsengőben vannak. Az agykéreg csökkent ADC értékei a citotoxikus ödémával magyarázhatóak, amely a rövid, heveny görcsök esetében elsősorban az astrocytákban jelennek meg. A kapillárisok átmérőjének csökkenése rontja a helyi mikrocirkulációt, hozzájárulhat az ADC értékek csökkenéséhez. A rCBV értékek egyidejű növekedése az arteriolák és nagyobb erek szintjén fellépő kompenzatorikus változásokat jelzi. Korábbi eredményeink szerint az MK-801 előkezelésben adva szignifikánsan csökkentette a GTCS kialakulását, de nem befolyásolta látenciáját. Az MK-801 hatására az állatokban izomhypotonia, bizonytalan mozgás, posturalis kontrollzavar, sztereotipikus mozgások jelentek meg. A GYKI 52466 megnövelte a GTCS látenciáját, az állatok túlélése 100%-os volt, ismételt GTCS nem fordult elő. A GYKI 52466 mellékhatásaként izomhypotonia és csökkent locomotor aktivitás volt megfigyelhető. MK-801 csökkentette a Fos-IR-t a neocortexben és a hippocampalis CA1-3 szektorokban, a kontrollokéval összevetve. A GYKI 52466 dózisfüggő hatását elemezve egyrészt különböző, dózisfüggő aktivitási állapotokat feltételezhetünk az AMPA-receptoroknál, továbbá azt, hogy az alacsonyabb antagonista dózis nem elégséges a görcstevékenység során megemelkedő GLU koncentrációval szemben. A GYKI 52466 hatékonyabb volt az ictalis esemény késleltetésében, irodalmi adatok alapján az AMPA-receptorok jelentősebb szerepet játszanak a görcstevékenység kialakulásában, mint a fenntartásában és a terjedésében. A neocorticalis AMPA-receptorok többsége a II-III és V-VI laminákban található, ahol a magasabb dózis esetében szignifikáns csökkenés következett be a neuronális aktivációban. Az intracorticalis hálózatokban az NMDA-receptoriális mediáció a jelentősebb, ezek a kapcsolatok a GYKI 52466 jelenlétében is aktívak maradnak. Az alacsonyabb antagonista dózis esetében egy helyi egyensúly-felborulás következhet be az inhibitoros sejtpopuláció gátlásának hatékonysága és a teljes (inkább excitatorikus) sejtpopulációra gyakorolt hatása között. Az egyébként több szempontból is igen heterogén gátló sejtpopuláció hasonló AMPA-receptor sajátosságokkal rendelkezhet, mint a kérgi pyramissejtek, mivel a magasabb GYKI 52466 koncentráció volt szükséges a szignifikáns hatás eléréséhez. A tanulmányozott hippocampalis területeken az alacsonyabb GYKI 52466 koncentráció is elegendő volt a c-fos-IR csökkentéséhez, nemcsak a parvalbumin-pozitív gátló, hanem a teljes c-fos-IR sejtpopulációban; a hippocampus eltérő receptoriális eloszlását, és a gátló valamint a serkentő axonrendszerek térbeli elkülönülését jelezve. A görcstevékenységhez kapcsolódó astrocyta-duzzadás multifaktoriális, részben keringési, részben metabolikus eredetű. Bár az irodalmi adatok korlátozottak az AMPA-receptorok szerepével kapcsolatban, ugyanakkor az MK-801 hatékony a glutamát-kiváltotta astrocyta-duzzadás mérséklésében. A GYKI 52466 kísérleteinkben az AMPA-blokád elégtelennek bizonyult a konvulziókhoz kapcsolódó astrocyta-duzzadás csökkentésében, mint ahogy más tanulmányok is megkérdőjelezik a GYKI 52466 protektív hatását a görcstevékenységhez társuló morfológiai elváltozások kivédésében. Ugyanakkor, a 4-AP paradigmában az MK-801 hatásosnak bizonyult az agyödéma szignifikáns csökkentésében, jelezve a két ionotróp receptor szerepének eltérő voltát a morfológiai elváltozásokban. 6. KÖVETKEZTETÉSEK Tanulmányunkban leírtuk a 4-AP-vel kiváltott akut görcstevékenység jellemzőit strukturális és funkcionális MRI segítségével. Ezek az első irodalmi MRI adatok a 4-AP akut konvulziós modellről. Eredményeink alapján arra következtethetünk, hogy az astrocyta-duzzadásban az AMPA receptorok által mediált folyamatok kis jelentőségűek, mivel az AMPA-receptorok gátlása nem akadályozta meg a konvulzió-kiváltotta astroglialis duzzadást. További vizsgálatoknak kell feltárniuk az astrocyták glutamát-receptorainak szerepét a 4-AP-kiváltotta akut konvulziókban, és a generalizált tónusos-klónusos görcsökkel kapcsolatos astrocyta ödéma kórélettanában. Összegezve eredményeinket, úgy tűnik, hogy a GYKI 52466 fő protektív hatása a görcstevékenység mérsékelt gátlásán alapul (megnövelve a GTCS látenciáját és csökkentve a kísérleti állatok letalitását); bár a relatíve rövid hatástartam szintén hozzájárulhatott a GYKI 52466 korlátozott hatásához. Adataink alapján a görcstevékenységhez társuló sejtszintű károsodások (mint például az astrocyta-duzzadás) kialakulásának mechanizmusában az NMDA-receptoroknak sokkal fontosabb szerepük van, mint az AMPA-receptoroknak. A hippocampusban, a sejtaktivációban (ellentétben az astrocyta-duzzadással) az AMPA-receptorok jelentősége nagyobb, mint a neocortexben. Mindezek alapján, az irodalmi adatokkal összhangban azt gondoljuk, hogy az AMPA-receptorok jóval inkább a görcstevékenység kiindulásában, mint fenntartásában és terjedésében vesznek részt. Az AMPA-receptorok részvételének eltérő mértéke az neocorticalis és hippocampalis neuronkörök szerveződésében tükröződik a GYKI 52466 görcstevékenységet kísérő neuronális aktivációt csökkentő eredményességének különbségében. Tapasztalataink alapján a 4-AP görcsmodellben az inkább az NMDA-receptor, mint az AMPA-receptor antagonistái játszanak döntő szerepet a heveny morfológiai változások kivédésében, mint például az astrocyta-duzzadás.

Mű típusa: Disszertáció (Doktori értekezés)
Doktori iskola: Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Tudományterület / tudományág: orvostudományok > klinikai orvostudományok
Magyar cím: Ionotróp glutamát antagonizmus A 4-aminopiridinnel kiváltott patkány akut konvulziós modellben: A heveny görcstevékenység morfológiai és funkcionális vonatkozásai
Idegen nyelvű cím: Ionotropic glutamate antagonism in the 4-aminopyridine rat convulsion model: the morphological and functional aspects of the acute seizure
Témavezető(k):
Témavezető neveBeosztás, tudományos fokozat, intézményEmail
Prof. Dr. Mihály Andrástanszékvezető egyetemi tanár, az MTA Doktora, SZTE ÁOK Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézetmihaly@anatomy.szote,u-szeged.hu
EPrint azonosító (ID): 572
Publikációban használt név : Dr. Weiczner Roland
A feltöltés ideje: 2010. okt. 18. 16:26
Utolsó módosítás: 2017. jún. 23. 14:00
Egyebek (raktári szám): B 4665
URI: http://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/572
Védés állapota: védett

Actions (login required)

Tétel nézet Tétel nézet

Letöltések

Letöltések havi bontásban az elmúlt egy évben