A Drosophila melanogaster Fcp1 foszfatáz szerkezetének és funkciójának vizsgálata

Tombácz István
A Drosophila melanogaster Fcp1 foszfatáz szerkezetének és funkciójának vizsgálata.
Doktori értekezés, Szegedi Tudományegyetem.
(2010)

[img]
Előnézet
PDF (disszertáció)
Download (2MB)

Absztrakt (kivonat) idegen nyelven

Az eukarióta szervezetekben a fehérjekódoló géneket az RNS Polimeráz II (RNAPII) írja át. Legnagyobb alegysége (Rpb1) a C-terminálisán sajátságos domaint tartalmaz, ami a Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser konszenzus szekvencia tandem ismétlődéseiből áll. Az ismétlődések száma a különböző élőlényekben eltérő (26 élesztőben, 52 emberben), de a szekvencia az evolúció során konzervált. Ez a C-terminális domain (CTD) a sejtek életbemaradásához nélkülözhetetlen. Számos vizsgálat bebizonyította, hogy a CTD nagymértékben foszforilálódhat, és a foszforiláltság foka nem állandó. Az RNAP II két jól elkülöníthető konformációs állapota az RNAP IIO (hiperfoszforilált) és az RNAP IIA (hipofoszforilált), melyeknek más a funkciója a transzkripció során. A IIA formában az enzim képes a promóteren összeszerelődött preiniciációs komplexhez kapcsolódni. A CTD foszforilálása az iniciáció során történik, és lehetővé teszi a polimeráz promóterről való elindulását, vagyis az elongációt a IIO forma végzi. Ahhoz, hogy az enzim újra átírásba kezdhessen, a CTD-nek defoszforilálódnia kell. A CTD ezenkívül kötőhelye az RNAPII-vel kölcsönható fehérjék egy részének, melyek kötődését befolyásolja a CTD foszforiláltsági mintázata. Tehát a CTD kinázoknak és foszfatáz(ok)nak rendkívül fontos szerepük van a génexpresszió szabályozásában. Több CTD-t módosító kinázt, és néhány foszfatázt már azonosítottak, utóbbiak közül a legismertebb a TFIIF-el kapcsolódó CTD foszfatáz, az Fcp1. Az Fcp1-et eddig elsősorban élesztőben vizsgálták in vivo alkalmazható módszerekkel, magasabbrendű eukariótákból főleg csak in vitro nyert eredmények állnak rendelkezésre, ezért kutatásom során egy olyan rendszert szerettem volna létrehozni, melynek segítségével in vivo információkat nyerhetünk az Fcp1 szerepéről magasabbrendű szervezetekben. Modellorganizmusként a Drosophila melanogaster-t használtam, mert nagyszámú genetikai és biokémiai módszer áll rendelkezésre ezen élőlény vizsgálatához. A D. melanogaster Fcp1 fehérjéről eddig nem közöltek eredményeket, ezért mielőtt megkezdtem volna a tervezett kísérleteket, azonosítani kellett az enzim Drosophila homológját. A BLAST keresőprogram segítségével meghatároztam a dFcp1-et kódoló gént (CG12252), ezután a cDNS és genomi szekvenciát klónoztam. A szakirodalom szerint az élesztő és humán Fcp1 kölcsönhat az RNAPII 4. legnagyobb alegységével, az Rpb4-gyel. Élesztő két-hibrid módszerrel kimutattam, hogy az általam azonosított CG12252 gén terméke szintén képes kapcsolódni a dRpb4-hez. Valamint azt találtam, hogy a fehérje C-terminálisán egy transzkripció-aktiváló domaint tartalmaz. Ezt szintén kimutatták már más Fcp1 orthológok esetében. Az Fcp1 mennyiségének in vivo változtatása céljából transzgenikus Drosophila törzseket hoztam létre; a transzgének az UAS-GAL4 rendszerrel fejezhetők ki. Ez a rendszer lehetővé teszi adott szekvenciák szövet- és/vagy fejlődési stádium-specifikus expresszióját. Az Fcp1 gént Drosophila melanogaster-ben túltermeltetve, vagy az endogén Fcp1 szintet RNS interferenciával lecsökkentve azt tapasztaltam, hogy az állatok különböző fejlődési stádiumokban elpusztulnak, vagy adott szerveiken defektusokat hordoznak, az alkalmazott GAL4-forrás függvényében. A megfigyelt fenotípusok arra engedtek következtetni, hogy az állatokban apoptózis játszódik le. Akridin-orange festéssel kimutattam, hogy valóban erről van szó, a mutánsok azon szöveteiben, ahol az Fcp1 szint megváltozik, nagyszámú apoptotizáló sejtet láthatunk. Az apoptózis mechanizmusának egyik kulcsfehérjéje a p53, ezért felmerült a kérdés, hogy a megváltozott Fcp1 szint okozta fenotípusok kialakulásában szerepet játszik-e a p53. Kimutattuk, hogy p53 hiányában az Fcp1 szint csökkenés hatására kialakuló fenotípusok enyhülnek, míg abban az esetben, ha túltermelünk egy domináns negatív hatású (transzkripció-aktivációra képtelen) p53-at, a fenotípusok súlyosbodnak. A domináns-negatív p53 nem képes az apoptotikus kaszkádban részt vevő célgénjeit aktiválni, közreműködhet azonban transzkripciót nem igénylő apoptózis indukálásában. Ez ebben az esetben érthető, annak fényében, hogy az Fcp1 szint változása a transzkripciót globálisan gátolja, így egy transzkripció-dependens apoptotikus útvonal nem lehetne hatékony. Vizsgálatainkkal bizonyítottuk, hogy az Fcp1 helyes működése elengedhetetlen a D. melanogaster normális egyedfejlődéséhez. Mennyisége szigorúan szabályozott, hiszen expressziója szintjének növelése, vagy kismértékű csökkentése is az állatok halálához vagy hibás szövetek/szervek kialakulásához vezet. Ezen defektusok minden bizonnyal a transzkripció helyes működésének akadályoztatása révén jönnek létre, mely esetben az érintett sejtek apoptotizálnak. Ebben a folyamatban a p53 fontos szerepet játszik, célgénjeinek aktiválása nélkül, transzkripció-független úton. Kísérleteink során létrehoztunk egy olyan rendszert, mellyel az Fcp1 funkciója és a CTD foszforilációjának szerepe in vivo vizsgálható egy magasabbrendű eukariótában.

Mű típusa: Disszertáció (Doktori értekezés)
Doktori iskola: Biológia Doktori Iskola
Tudományterület / tudományág: természettudományok > biológiai tudományok
Magyar cím: A Drosophila melanogaster Fcp1 foszfatáz szerkezetének és funkciójának vizsgálata
Témavezető(k):
Témavezető neveBeosztás, tudományos fokozat, intézményEmail
Prof. Boros ImreNEM RÉSZLETEZETTNEM RÉSZLETEZETT
EPrint azonosító (ID): 561
Publikációban használt név : Tombácz István
A feltöltés ideje: 2010. ápr. 29. 08:27
Utolsó módosítás: 2014. szept. 01. 14:17
Egyebek (raktári szám): B 4735
URI: http://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/561
Védés állapota: védett

Actions (login required)

Tétel nézet Tétel nézet