Az akut L-kinurenin szulfát kezelés magatartási, szövettani és keringési hatásainak komplex vizsgálata C57Bl/6j egér törzsben

Varga Dániel Péter
Az akut L-kinurenin szulfát kezelés magatartási, szövettani és keringési hatásainak komplex vizsgálata C57Bl/6j egér törzsben.
PhD, University of Szeged.
(2017)

[img]
Preview
PDF (tézis)
Download (498kB) | Preview
[img]
Preview
PDF (tézis)
Download (406kB) | Preview
[img]
Preview
PDF (disszertáció)
Download (2MB) | Preview

Abstract in Hungarian

A triptofán több mint 95% a a kinurenin útvonalon keresztül metabolizálódik, mely folyamat során számos biológiailag aktív anyagcseretermék keletkezik. Az útvonal egyik központi terméke az L kinurenin (L KYN). A metabolizmus kezdeti szakasza elsősorban a májban és a vesében zajlik, az L KYN átalakítása viszont már az agyban is hatékonyan képes végbemenni. A vér agy gát, mint limitáló tényező, erősen korlátozza a központi idegrendszer és a perifériás kinurenin metabolizmus közötti átjárhatóságot. A kinurenin útvonalon található anyagcseretermékek jelentős része csak passzív diffúzióval rendkívül alacsony hatékonysággal képes átlépni a vér agy gáton. Kivételt képez az L KYN, ami az L1 típusú semleges aminosav transzportereken keresztül könnyedén közlekedik a periféria és az agyszövet között. Ezért a központi idegrendszer kinurenin metabolizmusa a perifériás L KYN koncentráció változásra különösen érzékeny. Állatkísérletes eredmények sora igazolja, hogy egészséges felnőtt emlősben a szisztémás L KYN koncentráció mesterséges növelésére a központi idegrendszerben bekövetkező legjellemzőbb és leggyorsabb reakció a kinurénsav (KYNA) szint dózisfüggő emelkedése. A KYNA szélesspektrumú receptormoduláló, antioxidáns és neuroprotekciós potenciállal rendelkező endogén molekula. Összetett pre és posztszinaptikus receptorhatásainak köszönhetően jelentős befolyást gyakorol mind a fejlődő, mind a felnőtt idegrendszer szinaptikus jelátvitelének hatékonyságára. A KYNA képes a glutamát felszabadulásának közvetlen és közvetett mérséklésére egyrészről a preszinaptikus terminálisokon található α7 nikotinos acetilkolin receptoron kifejtett nem kompetitív gátló hatása, valamint a neuronokon és asztrocitán expresszált Gi fehérje asszociált receptor 35 aktiválása révén. Az egészséges agyszövetben a KYNA mennyiségében bekövetkező fokozódás elsődleges funkcionális következménye tehát a glutamát extracelluláris koncentrációjának csökkenése. Minden bizonnyal erre másodlagos hatásként jelentkezik a többi neurotranszmitter szintjében megfigyelhető fluktuáció (acetilkolin, dopamin, GABA). Összességében elmondható, hogy az egyes neurotranszmitterek felszabadulása az agyi KYNA szint fordított arányú kontrollja alatt áll. A KYNA továbbá képes csillapítani a serkentő jelátvitelt, a posztszinaptikus membránrészen található NMDA receptor kompetitív gátlásával. Ezenkívül ligandja egy helix loop helix fehérje családba tartozó transzkripciós faktornak, az aril hidrokarbon receptornak, melyen keresztül gyulladáscsökkentő hatású. A receptormoduláló hatásai mellett pedig antioxidáns tulajdonságát is kimutatták. Ezek alapján nem meglepő, hogy az agyi KYNA szint kísérletes emelése állatkísérletes eredmények alapján ígéretes terápiás lehetőségként mutatkozik a neuroinflammáció, illetve a glutamát excitotoxicitás számos formájában. Kutatócsoportunk munkájával eredményesen járult hozzá az L KYN adagolás neuroprotekciós hatékonyságának kimutatásához a neurodegeneráció és az ischaemiás stroke kísérletes állatmodelljeiben. Az agyi KYNA szint emelés terápiás alkalmazhatóságának felmérése során ugyanakkor igen nagy körültekintéssel szabad csak eljárni, ugyanis a glutamát jelátvitel alulműködése éppúgy káros lehet, mint annak túlműködése. Ennélfogva a kinurenerg manipuláció következtében nem kívánt mellékhatások megjelenésével is szükséges számolni. Preklinikai tanulmányok során az akut és krónikus L KYN adagolás sok esetben hipoaktivitást és a térbeli tájékozódás zavarát okozta, szélsőséges esetekben pedig részben skizofréniára is jellemző kóros viselkedést idézett elő a vizsgált állatokban. A pre és posztnatális L KYN expozíciót pedig összefüggésbe hozták a felnőtt korra kialakuló tanulás és figyelemzavarral. Összességében elmondható, hogy a KYNA túltermeltetés receptorszintű és sejtszintű hatásaival kapcsolatban meglehetősen részletes ismeret áll rendelkezésre, ugyanakkor néhány tanulmányt leszámítva a KYNA szint emelés intakt, felnőtt idegrendszerre gyakorolt szervezetszintű, viselkedésben megnyilvánuló rövid és hosszú távú hatásai vonatkozásában az irodalom meglehetősen hiányos. Nem készült többek közt olyan átfogó dózis hatás tanulmány, amely alapján lehetőség nyílna elkülöníteni: küszöb alatti, küszöb feletti, illetve szélsőséges hatásokat. Ráadásul korlátozott ismeret áll rendelkezésre az esetleges fajok közti különbségekről. Ugyanis az akut viselkedésváltozásokat leíró tanulmányok szinte kizárólag patkányon végzett mérésekből származnak, miközben ismeretes, hogy maga a kinurenin metabolizmus sem egyforma az egyes emlősök között. A C57Bl/6 a genetikai módosításokhoz használt legelterjedtebb egér típus. Ugyanakkor a vad típusban az akut KYNA szint fokozás szervezetszintű hatásairól semmilyen adat nem áll rendelkezésre. Éppen ezért fontos lenne az egér törzs ilyen irányú karakterizálására, ami később megfelelő viszonyítási alapot nyújthatna a célzott génmanipulációs kísérletekhez, illetve felfedheti az esetlegese fajok közti különbségeket. A neurofiziológiai hatásokon túl egyre több eredmény szól amellett, hogy a kinurenin metabolitok közül a KYNA, illetve az L KYN közvetlenül szerepet játszhat a szisztémás vérnyomás és az agyi vérkeringés szabályozásában. Kimutatták, hogy a szisztémás gyulladás (szepszis) során jelentkező hipotenzió kialakulásáért részben az érendotélből nagy mennyiségben felszabaduló L KYN tehető felelőssé. Egy másik tanulmányban az L KYN alacsony dózisú intravénás adagolása (1 mg/ttkg) az agykérgi vérátáramlás (CBF) fokozódását okozta éber nyulakban. Ezek alapján joggal feltételezhető, hogy az akut szisztémás L KYN koncentráció növekedés befolyással lehet az egészséges felnőtt szervezet vérnyomására, illetve nyugalmi CBF ére. Ennek megfelelően célul tűztük ki, hogy megvizsgáljuk a C57Bl/6j egér törzsben milyen viselkedésváltozásokat okozhat a különböző dózisú (25 mg/ttkg – 300 mg/ttkg) szisztémás akut L KYNs kezelés. Ezenfelül immunhisztokémiai módszer segítségével kimutatjuk az akut L KYNs kezelés idegszövetre gyakorolt hatásait, a bazális c Fos expresszió változásának nyomon követésén keresztül. Azokat az agyterületeket vizsgálva, amik a viselkedésvizsgálatokkal szoros összefüggésbe hozhatók. Elhatároztuk továbbá, hogy felmérjük az egyszeri L KYNs kezelés befolyását a szisztémás artériás középvérnyomásra (MABP) és az agykéreg, azon belül is a szomatoszenzoros kérgi terület vérátáramlására. A viselkedéstesztekkel az L KYNs akut hatásait mértük fel, ezért az állatokat egyszer oltottuk, két órával a vizsgálatok megkezdése előtt. Kísérleteink során az állatok mozgási aktivitását (nyílt porond teszt), epizodikus memória funkcióját (új tárgy felismerés teszt) és a szorongással kapcsolatos viselkedését (emelt keresztpalló teszt) vizsgáltuk. Az állatok az alacsonyabb dózisú kezelések következményeként hipoaktivitást, míg a 100 mg/ttkg dózis felett hiperaktivitást mutattak. A legmarkánsabb lokomotoros aktivitásbeli eltérést a 300 mg/ttkg al kezelt csoport esetén tapasztaltuk. Ezzel igazoltuk, hogy a mérsékelt koncentrációjú kezelés a patkányokhoz hasonló lokomotoros aktivitás depresszáló hatású egerekben is. A koncentráció fokozással azonban, az NMDA receptor gátlással analóg, hiperaktív mozgásmintázat válik dominánssá. Ezzel feltártuk az L KYN dózis és a mozgási aktivitás közötti nem lineáris kapcsolatot. Az új tárgy felismerési teszt során a magasabb dózisú L KYNs kezelések (100 mg/ttkg; 300 mg/ttkg) rontották az egerek tárgyfelismerési memória teljesítményét. Ez alapján elmondható, hogy az alacsony dózisú kezelés nem befolyásolja az epizodikus memóriát, míg a mérsékelt koncentrációjú kezeléstől kezdve már amnesztikus hatással is számolni kell. Az állatok a dózis növelésével arányosan több időt töltöttek az emelt keresztpalló erősen megvilágított nyílt karjaiban. Kísérleteink során tehát kimutattuk, hogy az egyszeri L KYNs kezelés a dózis növeléssel egyenes arányú szorongásoldó hatású egerekben. A szövettani vizsgálatok során kimutattuk, hogy az egyszeri magas koncentrációjú (300 mg/ttkg) L KYNs kezelés csökkenti az alap c Fos expresszió mértékét a dorzális striátum és a hippokampusz CA1 régió térületén. Eredményünkkel felfedtük, hogy a KYNA markáns fokozódása a transzkripciós szabályozás megváltoztatásán keresztül is képes lehet az agyi plasztikus folyamatok befolyásolására, ezzel idézve elő rövid és hosszú távú viselkedésváltozásokat. Az utolsó kísérletsorozatban a magas koncentrációjú (300 mg/ttkg) egyszeri L KYNs kezelés keringésre gyakorolt hatásait mértük fel izoflurán altatott egereken, az adagolást követő két és fél órás időablakban. A MABP t a bal artéria femoralisba vezetett kanülön keresztül közvetlenül véres úton mértük. A nyugalmi CBF et pedig lézer folt interferencia (lézer speckle) kontrasztanalízisen alapuló eszközzel intakt koponyán keresztül vizsgáltuk. A kezelés a MABP t nem befolyásolta, ugyanis az, mindkét állatcsoportban az egész mérés során egyenletes és stabil volt (69 ± 4 és 73 ± 6 Hgmm; kontroll és kezelt). Ellenben a parietális agykérgi vérátáramlásban az L KYNs beadását követő 60 120 percben 22 ± 6% os, 7 ± 3 percig tartó hipoémiás CBF csökkenéseket tapasztaltunk. Kísérletünk során tehát kimutattuk, hogy az egyszeri magas koncentrációjú L KYNs kezelés destabilizálja a nyugalmi CBF et, a szisztémás vérnyomás befolyásolása nélkül. A kinurenin manipulációval kapcsolatos vizsgálatok között az L KYNs kezelés CBF mérséklő hatása újszerű. Eredményeink alapján egyértelmű, hogy a kinurenin manipulációval kapcsolatos beavatkozások során számolni kell annak keringésre gyakorolt hatásával is. Egyre elfogadottabbá válik, hogy a kinurenin metabolizmus felborulása szoros összhangban áll számos neurodegeneratív betegség során fellépő neurofiziológiai működészavar kialakulásával és súlyosbodásával. A terápiás beavatkozási lehetőségek keresése kapcsán ezért széles körben elterjedt a kinurenin metabolitok elérhetőségének mesterséges manipulálásán alapuló módszerek feltérképezése. Jóllehet számos közlemény foglalkozik a kinurenerg manipuláció neuroprotekción kívüli hatásaival is, átfogó dózis hatás tanulmány a témában korábban még nem készült. Az eredményeink alapján világosan látszik, hogy a mérsékelt dózisú L KYNs kezeléstől kezdve számos viselkedési funkciózavar jelentkezhet, ami a dózis fokozással egyre kiterjedtebbé és intenzívebbé válik. A nagy dózisú kezelés eredményeként pedig génexpressziós változással és a nyugalmi agyi vérátáramlás destabilizálódásával is számolni kell. Ezeket a jelenségeket fontos lehet bármilyen jövőbeli kísérletes, illetve terápiás kinurenerg manipuláción alapuló beavatkozás kapcsán számításba venni.

Abstract in foreign language

L-Kynurenine (L-KYN) is a central metabolite of tryptophan degradation: known as kynurenine pathway, it is a cascade of enzymatic steps generating biologically active compounds, through which more than 95% of the tryptophan is catabolized. The early phase of the catabolic steps takes place mainly in the liver and the kidneys. However, the metabolization of L-KYN can effectively proceeds in the brain. The blood brain barrier strongly limits the penetrability of the kynurenine metabolites from the periphery to the central nervous system, since most of them can only be transferred by passive diffusion with a very low efficacy. One clear exception is the L-KYN, which can enter the brain with the aid of a large neutral amino acid transporter. Thus, the cerebral kynurenine metabolism is very responsive to the peripheral level of the L-KYN. Preclinical studies have shown that growth in the level of systemic L-KYN is particularly associated with a dose-dependent increase of its direct downstream metabolite kynurenic acid (KYNA) in the central nervous system. Evidence suggests that in the physiologically intact brain the most prominent and rapid change after peripheral L-KYN administration is the peak elevation of KYNA. KYNA is a complex neuromodulator, antioxidant and neuroprotective endogenous molecule. Elevation of brain KYNA content is correlated with attenuation in the concentration of extracellular glutamate, dopamine and acetylcholine in distinct cortical and subcortical brain regions. KYNA influences neurotransmission through multiple actions at the pre- and postsynaptic site. KYNA directly attenuates neurotransmitter release, partly by inhibiting α7 nicotinic acetylcholine (α7nACh) receptor located on presynaptic terminals, and partly by stimulating G-protein-coupled receptor 35 (GPR35) localized on neurons and astrocytes. Thus, even the modest fluctuations in endogenous KYNA can bi-directionally control the extracellular levels of glutamate. KYNA hinders postsynaptic N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor currents by competitive antagonism at allosteric glycine binding site of NMDA receptor. Moreover, in the periphery and in the brain during neuroinflammation, KYNA promotes anti-inflammatory responses due to activation of aryl hydrocarbon receptor and GPR35 receptor expressed by immune-cells, as well as it presumably also modulates neuronal survival through extrasynaptic NMDA receptor blockade. Besides its receptor-mediated actions, KYNA itself is a potent antioxidant. Therefore, elevation of brain KYNA level, either by administration of L-KYN or pharmacological manipulation of the availability of the kynurenine pathway enzymes, has become an attractive strategy to attenuate neuroinflammatory responses and to protect against glutamate induced excitotoxicity associated with ischemic brain injury. Accordingly, we and our collaborators achieved neuroprotection by the administration of L-KYN sulfate (L-KYNs) in experimental models of neurodegenerative diseases and ischemic stroke. Decades after the discovery of the neurotoxic and convulsant properties of glutamate, it has become clear that glutamate hypofunction is also pathogenic and therefore undesirable. Accordingly, in preclinical studies acute or chronic elevation of brain KYNA content, achieved partly by the peripheral administration of L-KYN, has been suggested to trigger alteration in the behavior of rodents: animals expressed hypoactivity or spatial working memory deficit. Moreover, pre- and postnatal chronic L-KYN exposure provoked long-lasting neurochemical and behavioral abnormalities manifested in adulthood. However, the results assessing the behavioral effects of the kynurenerg manipulations emerged from studies that focused mainly on rats, after various-dose of L-KYNs treatment. Implementing similar experiments in mice is of particular importance, because such data is almost absent from the literature. Additionally, the available information concerning the effects of kynurenerg manipulation beyond neuroprotection is quite incomplete, since study on dose-dependent responses to various L-KYNs treatment is not available. On a top of these, L-KYN and KYNA were attributed a direct role in the regulation of the systemic circulation. Namely, L-KYN was identified as an endothelium-derived vasodilator, contributing to peripheral arterial relaxation and regulation of blood pressure during systemic inflammation in rats. Furthermore, intravenous administration of low-dose L-KYN (1 mg/kg) has been shown to increase cerebral blood flow (CBF) in conscious rabbits. Therefore, we hypothesized that acute elevation of systemic L-KYN concentration may exert potential effects on mean arterial blood pressure (MABP) and on resting CBF in the adult mouse brain. Consequently, we set out to investigate the dose-dependent (25 mg/bwkg – 300 mg/bwkg) behavioral effects of the systemic administration of L-KYNs in naïve C57Bl/6j mice. To evaluate the changes in neuronal activity after L-KYNs treatment, in a separate group of animals we estimated c-Fos expression levels in the corresponding subcortical brain areas by means of immunohistochemical technique. Moreover, we decided to determine the influences of L-KYNs treatment on the systemic blood pressure and the cerebral vasoregulation of the adult mice. In the first set of experiments, we wanted to assess the acute effects of L-KYNs treatment on the behavior of the freely moving animals, thus the mice were administered intraperitoneally 2 h before the experiments. The ambulatory activity was assessed in an open field (OF) paradigm. Episodic-like memory performance was tested in an object recognition (OR) paradigm. Anxiety-like behavior was measured in elevated plus-maze (EPM) paradigm. In an OF paradigm the C57Bl/6j mice expressed hypoactivity owing to the lower dose L-KYNs treatment, whereas the animals become hyperactive as the dose was raised over 100 mg/bwkg. The most prominent locomotor disturbances were seen in the 300 mg/bwkg treated group. On the one hand we verified that moderate L-KYNs treatment hinders the locomotor activity of mice just as it was reported in rats. On the other hand, our data revealed that the high-dose L KYNs treatment impairs further the controls of voluntary movement by inducing an irregular hyperactive state. Thus we uncovered a non-linear dose dependent characteristic of the L-KYNs treatment on the locomotor activity of mice. Besides the changes in the moving pattern, the moderate to high-dose L-KYNs treatments (100 mg/bwkg, 300 mg/bwkg) completely abolished the formation of object recognition episodic memory. Thus the amnestic properties of the kynurenerg manipulation was verified in mice. Additionally, in the EPM paradigm the animals spent more time in the aversive open spaces of the platform. Consequently, the treatment dose-dependent anxiolytic effect was uncovered. There is an unequivocal relationship between hippocampal c- Fos expression and memory formation. The relationship between basal ganglia activity and c-Fos expression is also described. For this reason, we targeted the hippocampus, which definitely corresponds to memory formation, and the striatum, which regulates movement velocity. The high-dose L-KYNs treatment (300 mg/bwkg) decreases the number of c-Fos-immunopositive-cells in both areas. Thus our data revealed that behavioral abnormalities owing to a single exposure of high-dose L-KYNs may emerges related to the altered basal c-Fos protein expression and the imbalance of the striatal and hippocampal neuronal activity. In the last set of experiment, we set out to obtain comparable information about the potential vascular effects of L-KYNs. MABP was monitored in the femoral artery, while CBF was assessed through the intact parietal bone with the aid of laser speckle contrast imaging. L-KYN sulfate (L-KYNs) (300 mg/kg, i.p.) or vehicle was administered intraperitoneally. Subsequently, MABP and CBF were continuously monitored for 2.5 h. In the control group, MABP and CBF were stable (69 ± 4mmHg and 100 ± 5%, respectively) throughout the entire data acquisition period. In the L-KYNs-treated group, MABP was similar to that, of control group (73 ± 6mmHg), while hypoperfusion transients of 22 ± 6%, lasting 7 ± 3 min occurred in the cerebral cortex over the first 60 – 120 min following drug administration. In conclusion, the systemic high-dose of L-KYNs treatment destabilizes resting CBF by inducing a number of transient hypoperfusion events. Until recently the possibility that this manipulation might interfere with the cerebrovascular regulation was not taken into account. The impairment of the kynurenine pathway metabolism is increasingly considered to be involved in the occurrence and the progression of neurophysiological dysfunctions observed in various neurodegenerative diseases. Thus, manipulation of the availability of kynurenine metabolites with the aim of therapy has been extensively investigated recently. Although, up to this point a detailed dose-response study related to the kynurenine manipulation effects beyond neuroprotection was not done. We have demonstrated that a single moderate L-KYNs administration can provoke numerous behavioral disturbances, whereas these effects become more dominant with the increase of L-KYNs concentration. Therefore, a single high-dose L KYNs treatment next to the behavioral influences, could also alter genexpression and destabilizes resting CBF, a phenomenon that should be considered by interpreting the effect of kynurenergic manipulation on brain function. By planning clinical trials basing on kynurenergic manipulation possible behavioral and vascular side effects should also be considered.

Item Type: Thesis (PhD)
Creators: Varga Dániel Péter
Hungarian title label: Az akut L-kinurenin szulfát kezelés magatartási, szövettani és keringési hatásainak komplex vizsgálata C57Bl/6j egér törzsben
Title of the thesis in foreign language: Complex analysis of behavioral, histological and cardiovascular influences of acute L-kynurenine sulfate administration in C57Bl/6j mice
Divisions: Doctoral School of Biology
Discipline label: Natural Sciences > Biology
Defence date label: 2017. November 13.
Item ID: 4090
Identification Number: 3349386
doi: https://doi.org/10.14232/phd.4090
Date Deposited: 2017. Oct. 04. 10:05
Last Modified: 2018. Mar. 19. 15:50
Depository no.: B 6293
URI: http://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/4090
Defence/Citable status: Defended.

Actions (login required)

View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year