Emésztőrendszeri diszfunkció és humorális immunválasz kapcsolata IV-es típusú kollagén mutációkkal Drosophilában

Kiss Márton
Emésztőrendszeri diszfunkció és humorális immunválasz kapcsolata IV-es típusú kollagén mutációkkal Drosophilában.
PhD, University of Szeged.
(2017)

[img]
Preview
PDF (disszertáció)
Download (2MB) | Preview
[img]
Preview
PDF (tézis)
Download (307kB) | Preview
[img]
Preview
PDF (tézis)
Download (240kB) | Preview

Abstract in Hungarian

Az extracelluláris mátrix (ECM) a sejten kívüli tér makromolekuláinak rendezett hálózata, amely a sejtek migrációját, fejlődését és túlélését biztosítja, kapcsolatot teremt a sejtek között, szövetté szervezi azokat, és részt vesz a kommunikációban. A többsejtű állati lét szinte elképzelhetetlen lenne nélküle. Az ECM fajonként és szervenként rengeteg különböző molekulából állhat, felépítésében mégis oroszlánrészt vállalnak a kollagén szupercsalád tagjai. Ezeken kívül megtalálhatóak benne a lamininek, a proteoglikánok, a glükózaminoglikánok, a fibronektin, a perlekán, a SPARC, a nidogén és gerincesekben az elasztin is. Az ECM egy speciális változata a bazális membrán, ami egyfajta határoló funkciót lát el. Szintézise általában az általa elválasztott két térrész sejtjei (pl. epitél, kötőszövet) együttes erőfeszítésének eredménye, muslicában azonban elsősorban a hemociták termelik. A bazális membrán két nagyobb egységre bontható: a bazális laminára, és a retikuláris laminára. A két réteget VII-es típusú kollagén kapcsolja össze. A kollagén egy nagyon érdekes fehérje (Pauling és mtsai, 1951). A kollagén szupercsaládot kilenc, különböző molekuláris szerkezetű és különböző funkciókat ellátó kollagén család alkotja. A kollagén molekula az N-terminális 7S doménből, a kollagén alegységből és a C-terminális NC1 doménből épül fel. A kollagén trimer összeszerelődése során három kollagén molekula, azaz három fehérjeszál alkot egy protomert. Részletes vizsgálatok kimutatták, hogy a triplahélix összeszerelődését a C-terminális NC1 domén irányítja. Az említett terminális domének feladata az egyes triplahelikális protomerek összekapcsolása. Az így kialakuló hálózat mintázata a drótkerítésre emlékeztet. Az élővilágban legelterjedtebb az (A1)2(A2) - (A1)2(A2) hálózat. A Drosophila melanogaster IV-es típusú kollagénjeit a col4a1 és a col4a2 gén kódolja. A vizsgált törzsek a col4a1 gén domináns, meleg- vagy hidegérzékeny (dominant temperature sensitive, DTS) alléljeit hordozzák. A mutánsokat etil-metán-szulfonát (EMS) mutagenezissel állították elő. A létrehozott l(2)25Ca DTS/CyRoi (meleg-) és az l(2)25Ca DCS/CyRoi (hidegérzékeny) heterozigóták, amik magas, illetve alacsony hőmérsékletre érzékenyek, restriktív körülmények között elpusztulnak. A DTS/DTS homozigóták még permisszív körülmények között sem életképesek, embrioletálisak. A kollagének poszt-transzlációs módosításában a lizin-hidroxilázok, a prolin-hidroxilázok, a lizil-oxidázok, a mátrix-metalloproteázok és a peroxidazin jut fontos szerephez. A IV-es típusú kollagén betegsége az Alport-szindróma, ami hematuriával jár, tünetei továbbá a vakság és a süketség. A Goodpasture-szindróma a vese és a tüdő COL4A3 láncának autoimmun betegsége. A HANAC-szindróma „tekervényes” retinális artériák, agyi aneurizmák, a vese szöveteinek abnormális fejlődésére visszavezethető vérvizelés, ciszták és izomgörcsök „képében” jelentkezik. A Walker-Warburg-szindróma egy szemfejlődési rendellenességekkel, izomdisztrófiával és idegsejt migrációs problémákkal jelentkező recesszív genetikai betegség. Amennyiben az érfal vérnyomással szembeni ellenállása meggyengül, az a születés körüli időszakban elszenvedett agyvérzésre és porenkefáliára hajlamosít. X-hez kötött süketséget okozhat a COL4A6 gén némelyik mutációja. Az ASD (anterior segment dysgenesis) egy több betegséget magában foglaló megnevezés, aminek tünetei a szemfejlődési rendellenességek okozta zöldhályog és látásvesztés. A közelmúltban leírtuk, hogy a col4a1 IV-es típusú kollagén gén kondicionális mutációját hordozó Drosophila melanogaster törzsben a sejtek alapmembrántól való elválása azok nagymértékű pusztulását okozza a közös petevezető harántcsíkolt-, valamint a bél simaizomzatában és annak epitélrétegében (Kelemen-Valkony és mtsai, 2012). Ebből kiindulva feltételeztük, hogy a mutánsban krónikus gyulladás alakul ki, az immunrendszer ebből kifolyólag erősen aktivált állapotban van. A mutáns lárvák bélcsatornájának vizsgálata divertikulumokat mutatott ki, amik környezetében a sejtmagok TUNEL-pozitívak restriktív hőmérsékleten; permisszív körülmények között ez a jelenség nem detektálható. A többsejtű eukariótákat folyamatos kihívások elé állítja saját rezidens mikroflórájuk. A lehetséges fertőzések leküzdésére a védekezési mechanizmusok széles skáláját fejlesztették ki az élőlények. Az ecetmuslica kizárólag veleszületett immunitással rendelkezik. A patogének elleni harcban a gazdaszervezet első, fizikai védelmi vonalát a külső és belső testfelszínek epitélsejt rétege jelenti, ami megtalálható többek között a trachea- és a bélrendszerben is. Ezen sejtréteg immunogén hatásra antimikrobiális peptidek és reaktív oxigéngyökök szintézisével válaszol, ami a behatás időtartamával arányosan károsítja az epitéliumot. Mivel a muslicában a gyulladásos állapot az AMP-k szintézisének megemelkedésével jár, feltettük a kérdést, hogy vajon a IV-es típusú kollagén mutánsokban tapasztalható-e hasonló jelenség restriktív hőmérsékleten. Microarray és qPCR kísérleteink igazolták bizonyos AMP gének (Metchnikowin, Diptericin, Diptericin B, Attacin C, Attacin A, edin) túlexpresszióját. A vad típusú kontrollban éppen ellenkező hatást tapasztaltunk, az említett gének kifejeződése csökkent a hősokkot követően, amit tovább erősített az Att-GFP fúziós fehérjét kifejező egyedekkel végzett vizsgálat. Az elvégzett génontológiai elemzés és a megváltozott kifejeződésű gének szervspecifikus termelődését összefoglaló táblázatok további betekintést nyújtanak a tárgyalt immunfolyamatok részleteibe. Kísérleteink során két, gyakran tanulmányozott szabadgyök koncentrációját vizsgáltuk meg. Míg a peroxi-nitrit szintje már permisszív hőmérsékleten is szignifikánsan magasabb volt a mutánsban ‒ ami restriktív körülmények között is emelkedett maradt ‒ addig a vad típusban látszólag csak restriktív hőmérsékleten nő a peroxi-nitrit koncentráció, bár ezen adatok alapján nem szignifikánsan. A H2O2 mennyisége a vad típusban a hőmérséklet emelés hatására alig nő, addig a mutánsban szignifikánsan nagyobb a hidrogén-peroxid koncentrációja restriktív hőmérsékleten. Feltételezhető, hogy a peroxi-nitrit megnövekedett koncentrációja a mutánsban hozzájárulhat a 20°C-on nevelkedett egyedek bélflórájának csíraszámában kimutatott csökkenéshez. A bélflóra összetételének vizsgálata az Acetobacter cerevisiae és a Lactobacillus plantarum jelenlétét igazolta, melyek CFU értékei restriktív körülmények között csökkentek a vad típusban és a mutánsban egyaránt. Az ampicillin és tetraciklin antibiotikumok keverékét tartalmazó táptalajon nevelt egyedek élettartama törzstől függetlenül hosszabb maximális élettartammal jellemezhető, bár a mutációt hordozó DTS-L3/CyRoi törzs féléletideje rövidebb volt alacsony hőmérsékleten, míg 29°C-on egyértelműen javult az állatok túlélése. A mutáns élettartama erősen lecsökkent 29°C-on. Az izolált bélbaktériumok tenyészetének orális adminisztrációjára – szájon át történő etetésére – a vad típusú és a mutáns állatok egyaránt érzékenyek, jelentősen csökkent az élethosszuk. Alacsonyabb csíraszám mellett jelentősen javult a kísérleti populációk maximális túlélése, ami egy felső tűrőképességi küszöbérték meglétére utalhat. A mutáns COL4A1 jelenléte a – normál esetben öregedés során megfigyelhető – SMURF fenotípus megjelenéséhez és intesztinális diszfunkcióhoz vezetett restriktív hőmérsékleten, fiatal egyedekben, ami jelentősen csökkentette élettartamukat. A col4a1 mutánsokban a megnövelt hőmérséklet hatására az AMP-k kifejeződése és a reaktív oxigén gyökök szintje igen nagymértékben megemelkedett, továbbá jelentős sejtpusztulás volt megfigyelhető, kapcsolatot teremtve ezáltal a IV-es típusú kollagén génjeit érintő mutációk, valamint az intesztinális diszfunkció és az AMP túlexpresszió között, jelezve a COL4A1 fehérje immunfolyamatokra kifejtett közvetett hatását. A mátrix‒integrin‒intracelluláris struktúrfehérje vonal bármely eleme, vagy azok fiziológiás működésében szerepet játszó protein hibás működése a mutánsainkban megfigyelhetőhöz hasonló tünetek megjelenéséhez vezethet.

Abstract in foreign language

The structure and function of the mucosal epithelia is determined and supported by the underlying basement membrane (BM). The BM functions in separation, epithelial cell polarization, absorption, sensation and secretion in various tissues and body compartments. The BM is a specialized form of the extracellular matrix, composed of numerous components with a predominance of type IV collagens COL4A1 and COL4A2. Mammals, including humans, harbor three pairs of type IV collagen genes (COL4A1-6). The inherited disorder of renal, ocular and cochlear basement membranes associates with mutations of the X-linked COL4A5 gene in the majority of patients with Alport syndrome, whereas lesions in the autosomal COL4A3 and COL4A4 genes are responsible for the symptoms of Alport syndrome in about 20% of patients. The majority of the mammalian BM is composed of building units of type IV collagen trimers with (COL4A1)2COL4A2 composition. Clinical manifestations associated with COL4A1 mutations include perinatal cerebral hemorrhage and porencephaly, hereditary angiopathy, nephropathy, aneurysms, and muscle cramps (HANAC), ocular dysgenesis, myopathy and Walker-Warburg syndrome. The latest reports demonstrate systemic tissue degeneration and pleiotropy associated with COL4A1 mutations and confirm the experimental observations that the phenotypes of COL4A2 mutations are phenocopies of COL4A1 gene mutations. The mucosal epithelia of the gastrointestinal tract are constantly challenged by the microbiome resulting in various types of interactions including commensalism, symbiosis and pathogenicity. Host-microbe interactions in the gut are studied only in a few animal models including Drosophila melanogaster. Antimicrobial defense in Drosophila is facilitated by phagocytosis of pathogenic microorganisms, by the synthesis of antimicrobial peptides (AMPs) and by the generation of reactive oxygen species. Gut-associated bacterial community in Drosophila is scarce, harboring 1-20 bacterial phylotypes. Recent studies identified five dominating commensal species in the gut of wild-type flies: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Acetobacter pomorum, Gluconobacter morbifer and Commensalibacter intestini. Overexpression of AMPs, demonstrated in caudal hypomorphic RNAi mutants, resulted in restructuring of the commensal bacterial population with the dominance of the pathogenic Gluconobacter morbifer accompanied by degradation of gut epithelial cells and high mortality of the host. These observations suggested a potential role for high levels of AMPs in epithelial cell degeneration, gut pathogenesis, and increased mortality. In aging flies, dysfunction of the intestinal barrier that normally permits the absorption of nutrients and solutes and hampers host contact with harmful entities including microorganisms has been, accordingly, tightly linked to overexpression of AMPs. Compromised intestinal barrier function was also noted in big bang (bbg) null Drosophila mutants. The BBG protein is localized in the gut epithelial septate junctions that, in the absence of BBG, are compromised and result in reduced lifespan and chronic inflammation of the anterior midgut epithelium in mutant animals. We have recently reported an allelic series of conditional, dominant, temperature-sensitive (DTS) mutations in the type IV collagen gene col4a1 in Drosophila. The col4a1mutant heterozygotes are viable and fertile at permissive temperature (20oC), but perish at restrictive temperature (29oC). The phenotype associated with mutations of col4a1 include severe myopathy resulting from massive degradation of striated muscle fibers and degeneration of both the circular smooth muscle cells and epithelial cells of the gut that occurs following detachment from the BM. While there are signs of some repair, the capacity of the scavenger system, and/or the kinetics of cell renewal and regeneration fail to keep up with the ongoing cell degeneration in these mutants. Based on these observations, we hypothesized that col4a1 mutants may suffer from extensive cell damage-induced chronic inflammation and demonstrate a robust immune response. In Drosophila, during inflammation the immune response involves the immediate synthesis of AMPs. Therefore, we have carried out a series of tests in order to determine whether AMP induction is associated with mutation-induced aberrant col4a1 functions in DTS-L3 mutants selected for analysis based on the presence of confirmed cell degeneration and its lowest survival rate among the col4a1 mutant lines at 29oC. After identifying the mutation sites in the col4a1 gene in each of our alleles we focused on the DTS-L3 mutant. We have noticed a TUNEL positive reaction in the intestinal tract of these animals at restrictive temperatures. Our results demonstrated overexpression of the AMP genes Metchnikowin, Diptericin, Diptericin B, Attacin A, Attacin C and edin, compared to their down-regulation in control animals. These experiments were fortified by the in vivo expression of GFP-tagged ATT proteins in the intestines in accordance with the expression pattern demonstrated at the mRNA level. Phylogenetic analysis of the gut bacteria identified in both mutant and control animals, Lactobacillus plantarum and Acetobacter cerevisiae as cultivable members of the intestinal microbial community with decreased CFU values under restrictive conditions. Antibiotic treatment resulted in lengthened maximal life spans, but similar half-lives. High dose diet of either Lactobacillus plantarum or Acetobacter cerevisiae was detrimental at high temperatures, but can be tolerated at 20°C. The same bacilli were less harmful when applied at lower CFUs. Data from this study support the conclusion that in col4a1 mutant Drosophila compromised BM function, gut epithelial cell detachment cause enlarged mid-gut with multiple diverticula, extensive cell degeneration, overexpression of AMP genes, collectively leading to intestinal dysfunction and shortened life span.

Item Type: Thesis (PhD)
Creators: Kiss Márton
Hungarian title label: Emésztőrendszeri diszfunkció és humorális immunválasz kapcsolata IV-es típusú kollagén mutációkkal Drosophilában
Title of the thesis in foreign language: Drosophila type IV collagen mutation associates with immune system and intestinal dysfunction
Divisions: Doctoral School of Biology
Discipline label: Natural Sciences > Biology
Defence date label: 2017. October 16.
Item ID: 4088
Identification Number: 3349076
doi: https://doi.org/10.14232/phd.4088
Date Deposited: 2017. Oct. 04. 19:33
Last Modified: 2018. Mar. 19. 14:20
Depository no.: B 6280
URI: http://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/4088
Defence/Citable status: Defended.

Actions (login required)

View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year