Antimikrobiális hatású gümő-specifikus ciszteinben gazdag (NCR) peptidek hatásmechanizmusának feltárása és a velük kölcsönhatásba lépő bakteriális fehérjék azonosítására alkalmas rendszer kidolgozása

Radvánszkiné Mikuláss Kata
Antimikrobiális hatású gümő-specifikus ciszteinben gazdag (NCR) peptidek hatásmechanizmusának feltárása és a velük kölcsönhatásba lépő bakteriális fehérjék azonosítására alkalmas rendszer kidolgozása.
Doktori értekezés, Szegedi Tudományegyetem.
(2016)

[img]
Előnézet
PDF (disszertáció)
Download (2MB) | Előnézet
[img]
Előnézet
PDF (tézis)
Download (436kB) | Előnézet
[img]
Előnézet
PDF (tézis)
Download (326kB) | Előnézet

Magyar nyelvű absztrakt

Napjainkban a gyakori és nem mindig megfelelően alkalmazott antibiotikum kezelések hatására számos úgynevezett multidrog rezisztens mikroorganizmus jelent meg. Ezek ellen a védekezés sokkal nehézkesebb, hosszabb kezelések szükségesek, melyek komoly problémákat okoznak a gyógyászatban. Így egyre sürgetőbb feladatot jelent újabb, a rezisztens kórokozók ellen hatásos antimikrobiális szerek felfedezése. Az antimikrobiális peptidek (AMP), mint új generációs antibiotikumok, új, hatékony megoldást nyújthatnak e problémára. AMP-k termelésére szinte minden élőlény képes, növényekben illetve gerinctelen és gerinces állatokban, mint vele született immunitás effektor molekulái jelennek meg. Ezek a peptidek gyors gátló, ill. ölő hatásuk miatt alkalmassá válhatnak a gyógyászatban már hatástalan antibiotikumok helyettesítésére. Az antimikrobiális peptideknek rendkívül gazdag forrásai a növények, melyek minden egyes részéből, úgymint a szárból, a levélből, a virágból és a termésekből, tudtak már izolálni ilyen molekulákat. Csoportunkban azonosították a defenzin típusú AMP-khez nagyon hasonló, specifikusan csak a szimbiotikus gyökérgümő rhizóbiumok által fertőzött sejtjeiben termelődő gümő-specifikus, ciszteinben gazdag peptideket (NCR: nodule-specific cysteine-rich peptides). Az NCR gének rövid, 25 – 60 aminosav hosszú, szekretált peptideket kódolnak, melyek érett formái négy vagy hat ciszteint tartalmaznak konzervált pozíciókban. A Medicago truncatula genomban azonosított közel 600 peptid elsődleges szekvenciáját tekintve gyenge homológiát mutat egymáshoz, és jelentős eltérések figyelhetők meg izoelektromos pontjukbanés expressziós mintázatukban. Kiderítettük, hogy a peptidek elsődleges szerepe valószínűleg a szimbionta partner terminális differenciációjának irányítása.A defenzinekhez való hasonlóságuk miatt korábban megvizsgáltuk van-e antimikrobiális tulajdonságuk, s kimutattuk, hogy a magasabb izoelektromos ponttal rendelkező, kationos NCR peptidek mind Gram negatív, mind Gram pozitív baktériumokkal szemben, illetve számos élesztőszerűen növő és fonalas gombával szemben is nagyfokú aktivitást mutattak. Munkám során az antimikrobiális tulajdonságokkal rendelkező kationos NCR peptidek hatásmechanizmusának pontosabb megismerése érdekében tanulmányoztuk, hogy miképp változik a baktériumok morfológiája, külső- és belső membránjuk átjárhatósága, illetve membránpotenciálja. A peptidek baktériumok morfológiájára kifejtett hatását atomerő ill. szkenning elektron mikroszkópos felvételekkel vizsgáltuk, melyek során a peptidek hatásmechanizmusának különbségei is felfedezhetőek voltak. Bizonyos peptidek a bakteriális sejtek aggregációját és a sejtfelszíni képletek rongálódása révén sejtek közötti hálózatos szerkezet megjelenését indukálták, mások pedig a baktérium sejtek kiürülését okozták. A kationos peptidek külső membránra kifejtett koncentrációfüggő membránkárosító hatását olyan neutrális, hidrofób festék (1-N-phenylnaphthylamine) segítségével mutattuk ki, mely csak a külső membrán megrongálódott szerkezeti elemei közé képes integrálódni. A belső membrán integritásának vizsgálata során kihasználtuk, hogy az intracelluláris β-galaktozidáz enzim szubsztrátja nem képes átjutni az intakt membránokon, így a peptidkezelést követő enzimaktivitás mérésével kimutattuk, hogy a kationos peptidek a külső membrán mellett a belső membránt is képesek károsítani. Kijelenthetjük, hogy a kationos peptidek antimikrobiális hatásának elsődleges oka a baktréiumok membránpotenciáljának eliminálása, melyet a fluoreszcens festék (DiOC2(3)) alkalmazásával is tudtunk bizonyítani. Mindazonáltal nem zárhatjuk ki, hogy egyes peptideknek sejten belüli célpontjai is lehetnek, ami a szimbiotikus kapcsolat kialakításában játszott szerepük alapján is feltételezhető. A peptidek sejten belüli kölcsönható partnereinek, célpontjainak azonosítására az egyik lehetőséget az élesztő kettős-hibrid technológia biztosítja. Munkám során a Sinorhizobium meliloti 1021-es törzsének összes prediktált ORF-jét tartalmazó ORFeome könyvtárat juttattam be egy általunk készített préda-vektorba, mely kompatibilis a klasszikus élesztő két-hibrid rendszerrel. A rendszer létrehozása és tesztelése során költséghatékony Gateway (LR) rekombinációs protokollt, illetve hatékonyabb élesztő transzformációs eljárást dolgoztunk ki, valamint igazolni tudtuk rendszerünk hatékonyságát, olyan fehérjék használatával, melyeknek ismertek a kölcsönható partnerei. A rendszer beállítása után megkezdtük az eddig legjobban ismert peptid, az NCR247 kölcsönható partnereinek azonosítását, melynek során képesek voltunk erős illetve gyenge kölcsönható partnerek meghatározására is. Az azonosított feltételezett kölcsönható partnerek közül kiválasztott néhány fehérje és a vizsgált kationos peptid közötti kapcsolatot más biokémiai technikák (immunprecipitáció, pull-down analízis) segítségével is sikerült bizonyítani. Az élesztő két-hibrid rendszer segítségével azonosított lehetséges kölcsönható partnerek azonban nagyrészt nem fednek át a már korábban affinitás kromatográfiával azonosítottakkal, melyből arra következtethetünk, hogy a rendszerünk nem helyettesíti, hanem kiegészíti a már megszerzett ismereteket.

Mű típusa: Disszertáció (Doktori értekezés)
Doktori iskola: Biológia Doktori Iskola
Tudományterület / tudományág: természettudományok > biológiai tudományok
Magyar cím: Antimikrobiális hatású gümő-specifikus ciszteinben gazdag (NCR) peptidek hatásmechanizmusának feltárása és a velük kölcsönhatásba lépő bakteriális fehérjék azonosítására alkalmas rendszer kidolgozása
Idegen nyelvű cím: A study on the mode of action of antimicrobial plant peptides and identification of their interacting partners with the help of novel S. meliloti based ORFeome library
Témavezető(k):
Témavezető neveBeosztás, tudományos fokozat, intézményEmail
Dr. Kereszt AttilaTud.Főmts. Ph.D. MTA SzBK Biokémiakereszta@gmail.com
EPrint azonosító (ID): 3139
Publikációban használt név : Radvánszkiné Mikuláss Kata
A mû MTMT azonosítója: 3196484
doi: 10.14232/phd.3139
A feltöltés ideje: 2016. okt. 11. 08:32
Utolsó módosítás: 2017. jún. 23. 14:59
Egyebek (raktári szám): B 6098
URI: http://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/3139
Védés állapota: védett

Actions (login required)

Tétel nézet Tétel nézet