A PhrA fotoliáz és szerkezeti homológja a PhrB kriptokróm szerepe a Synechocystis sp. PCC 6803 kettes fotokémiai rendszerének javítási ciklusában

Vass István Zoltán
A PhrA fotoliáz és szerkezeti homológja a PhrB kriptokróm szerepe a Synechocystis sp. PCC 6803 kettes fotokémiai rendszerének javítási ciklusában.
PhD, University of Szeged.
(2014)

[img]
Preview
PDF (disszertáció)
Download (1MB) | Preview
[img]
Preview
PDF (tézis)
Download (207kB) | Preview
[img]
Preview
PDF (tézis)
Download (169kB) | Preview
Official URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/php.120...

Abstract in Hungarian

A Földön élő fotoautotróf szervezetek olyan molekulakomplexekkel rendelkeznek, amelyek képesek együtt a napfény energiáját kémiai energiává alakítani (PSII, PSI, cyt b6/f, ATP-szintetáz), míg más molekulák, bizonyos hullámhossztartományú sugárzás hatására specifikus folyamatokat szabályoznak (fitokrómok, kriptokrómok, fototropinok, UVR8) az illető szervezetben. Mindezek során, napfény hatására, az illető molekulák átmeneti módosításokon esnek át, viszont a sugárzás intenzitásának és minőségének függvényében az említett molekulák szerepükből kifolyólag maradandó károsodást is szenvedhetnek. E jelenség nemcsak a fény hatására specifikus folyamatokat ellátó molekulákra korlátozódik hanem gyakorlatilag minden fényérzékeny molekulát érint. Ez utóbbiak közül a legfontosabb a DNS, amelyen az ultraibolya-B (UV-B) sugárzás (280-315 nm) jellegzetes szerkezeti változásokat hozhat létre. Természetes körülmények között, a napfény hatására módosítást illetve károsodást szenvedett molekulák vagy kijavítódnak és visszanyerik kiindulási formájukat, vagy helyettük új molekulák szintetizálódnak. A fotoszintetikus apparátuson belül a kettes fotokémiai rendszer (PSII) D1 fehérje alegysége hordozza, vagy köti a PSII elektrontranszportjában aktívan szerepet játszó redox kofaktorok túlnyomó részét. Ugyanakkor a vízbontó komplex kofaktorainak is a D1 biztosít kötődési helyet. Szerepüknél fogva a PSII D1 és D2 fehérjéi rendszeresen és viszonylag gyakran károsodnak. Az oxigéntermelő komplexszel együtt az UV-B sugárzás és általában a fotoinhibíció elsődleges célpontjának számítanak. A fotoszintetikus szervezetek nagy energiát fektetnek a károsodott alegységek gyors és hatékony pótlásába hiszen a fénynek szükségszerűen kitett fotoszintetikus apparátus hatékonysága ezektől függ. A D1 fehérje pótlása a PSII javítási ciklus legfontosabb része. Ez utóbbi több lépésből áll: 1. károsodott D1 és D2 alegységek proteolítikus eltávolítása, 2. hírvivő RNS átírása a psbA és psbD gének alapján, 3. fehérjék de novo szintézise a hírvivő RNS-ek alapján, 4. az újonnan szintetizált fehérjék beépülése a PSII komplexbe, 5. a vízbontó komplex, valamint a kis molekulatömegű fehérjék kapcsolódása és a PSII komplex aktiválása. Ha ez a javítási ciklus nem kellően hatékony és a károsodások mértéke túltesz a javítás mértékén, akkor fotoinhibícióról beszélünk. A fotoszintetikus apparátus mellett, az UV-B sugárzás a DNS-t is károsítja. Az UV-B energiájának hatására dimerizálódnak a DNS szerkezeti elemei és az esetek túlnyomó részében ciklobután pirimidin dimerek (CPD) jönnek létre. Mivel ezek a képletek akadályozzák a DNS és RNS polimerázok működését, annak függvényében , hogy a szervezet milyen gyorsan képes megszabadulni tőlük, akár letálisak is lehetnek. A fotoliáz egy olyan enzim, amely az UV-A és a kék fény energiáját használva specifikusan az említett képletek monomerizálódását katalizálja, méghozzá gyorsabban és jobb energiahatékonysággal, mint más, nem specifikus folyamatok, amelyek a káros képletek kimetszését végzik. Az fotoliáz által katalizált folyamat a fényreaktiváció, amely a DNS javítási ciklus egy specifikus változata. A PhrB fehérje a Synechocystis sp. PCC6803 fotoliázának (PhrA) szerkezeti homológja. Alig több mint egy évtizede azonosították és egy aminósav szekvencián alapuló molekulacsoportba, a DASH kriptokrómok (Drosophila, Arabidopsis, Synechocystis, Homo) közé sorolták. A PhrB pontos szerepét máig nem sikerült tisztázni. Az irodalomban szerepelt már gyenge fotoliázként, transzkripciós szabályzóként és kék fényreceptorként is, ami arra utal, hogy a fehérjének több folyamatban fontos szerepe lehet. Ezek ismeretében arra kerestük a választ, hogy: 1, Milyen hatása van a PSII helyreállítási ciklusának működésére a DNS javító enzim fotoliáz (PhrA) hiánya a Synechocystis sp. PCC 6803 cianobaktériumban? 2, Milyen szerepe van a fotoliázzal homológ PhrB fehérjének az UV-indukált DNS károsítás kijavításában, valamint a PSII helyreállítási ciklusának működésében a Synechocystis sp. PCC 6803 cianobaktériumban? Annak érdekében, hogy a DNS és a PSII javítási ciklusának kapcsolatát vizsgáljuk, olyan Synechocystis mutánst használtunk, amelyben a fotoliáz hiányának következtében (phrA-) nem volt jelen az UV-B-re specifikus DNS javítási ciklus. Azt találtuk, hogy a vad típussal (VT) összehasonlítva, UV-B sugárzás alatt, a phrA- sejtek gyorsabban veszítenek PSII aktivitásukból. Fehérjeszintézist gátló linkomicint adagolva a sejttenyészetekhez az is kiderült, hogy az ok, amiért a mutáns sejtek érzékenyebben reagálnak az UV-B sugárzásra, mint a VT, a PSII javítási ciklusának de novo fehérjeszintézisének lépésében keresendő. A PSII aktivitást tükrözte az is, hogy míg a VT sejtek a stresszkezelések alatt és után is képesek voltak a stresszmentes állapotukra jellemző mennyiségű D1 fehérjét előállítani, addig a mutáns sejtek D1 mennyisége a kezelések végére jelentősen lecsökkent. Ez utóbbi hatás maradandónak volt, a phrA- sejtek nem voltak képesek helyreállítani a D1 állományukat, az UV-B stressz megszűnte után sem. Mivel elméletben a hatékony de novo fehérjeszintézis egy bőséges hírvivő RNS (hRNS) tartományra támaszkodik, megvizsgáltuk, hogy UV-B sugárzás alatt hogyan alakul a D1-et kódoló és stresszkörülmények által indukált psbA3 transzkript szintje a két sejtvonalban. Az eddigi eredményeket alátámasztva, az alkalmazott UV-B stressz hatékonyan indukálta a VT sejtek psbA3 átírását, ami a stressz megszűntével visszaesett a kiindulási szintre. Egy, a stresszmentes regenerációt követő második adag UV-B sugárzással kimutattuk, hogy a VT-ban ismételten is indukálható a psbA3 átírása. Ezzel szemben a phrA- sejtekben már az első szakasznyi UV-B kezelés végére jelentősen alacsonyabban volt a sejtek psbA3 szintje a VT-hoz képest, ami a stressz hiányában sem változott, nem esett vissza az UV-B kezelés előtti szintre. A kezelés utáni, maradandó alacsony D1 szintet magyarázva a második adag UV-B sugárzás már nem hozott psbA3 indukciót a fotoliáz hiányos sejtekben. Mivel az első kezelés végétől fogva, a regenerációs szakaszon keresztül, a második kezelés végéig nem változott jelentősen a mutáns sejtek psbA3 szintje, arra következtettünk, hogy az UV-B által okozott specifikus képletek akadályozzák az RNS polimerázok működését. Így sem újabb psbA3 hRNS nem tudott képződni, sem pedig olyan hRNS molekulák, amelyek a már meglévő RNS állomány lebontásához szükséges fehérjéket kódolják. A DNS károsodások számszerűsítéséhez és azonosításához kétféle módszert alkalmaztunk: qPCR és alkalikus gélelektroforézis. A qPCR-re alapozott eljárás segítségével azt derítettünk ki, hogy az UV-B kezelés végére, a phrA- sejtekben, átlagosan majdnem 1 károsodás jut a genom minden 1kb szakaszára. Mivel a Synechocystis átlag génhossza 1kb körül van, ez egy igen szignifikáns jelenség. Ahhoz, hogy megállapíthassuk, hogy az ilyen mértékben felhalmozódott, DNS polimerázt gátló károsodások milyen arányban azonosak az UV-B által létrehozott CPD képletekkel, genomi DNS-t (gDNS) izoláltunk a sejtvonalakból és Endonukleáz V PDG enzimmel emésztettük. Ez utóbbi enzim specifikusan a CPD-nél hasítja a DNS molekulát, így minél több a károsodás annál kisebb fragmentumok jönnek létre az emésztés után. Alkalikus gélen a különböző méretű fragmentumok foltként jelennek meg és minél lennebb fut a folt, annál kisebb fragmentumok alkotják, tehát annál több szubsztrátumra lelt az enzim. A gélképeket kiértékelve és számszerűsítésevel azt találtuk, hogy a DNS polimerázt gátló képletek jelentős része UV-B által indukált CPD volt. A PhrB fehérje hatását a phrB- sejtek és a VT összehasonlítása alapján vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy a phrB- sejtek nemcsak UV-B stresszre, hanem magas intenzitású fehér fényre (FF) is érzékenyebben reagálnak mint a VT. Ez arra engedett következtetni, hogy a PhrB hatásköre nem korlátozódik az UV-B által létrehozott specifikus képletek kijavítására. Linkomicin alkalmazásával kiderítettük, hogy a phrA- sejtvonalhoz hasonlóan a phrB- sejtek fokozott stresszérzékenysége a PSII javítási ciklus de novo fehérjeszintézisével hozható kapcsolatba. Mivel nem csak az UV-B stresszel asszociálható, nem volt meglepő, hogy PHR hiányában nem halmozódott fel kimutatható mennyiségű CPD és az egyik leggyakrabban előforduló, oxidatív stressz következtében kialakuló 7,8-dihidro-8-oxoguanin DNS károsodás sem volt kimutatható UV-B kezelés után. Ez arra engedett következtetni, hogy a fotoliázzal ellentétben a PhrB nem a DNS javításán keresztül fejti ki hatását a PSII javítási ciklusára. Megerősítve a PhrB és a PSII javítási ciklusa közti összefüggést, kimutattuk, hogy míg a VT-ban nincs jelentős változás a D1 fehérjeállományban, sem az UV-B, sem pedig a FF stresszkezelések után, addig a phrB- sejtekben az jelentősen csökken. Mivel a phrB- sejtek genomjában nem halmozódott fel kimutatható mennyiségű DNS károsodás, nem szolgált meglepetésként, hogy a mutáns sejtek psbA3 hRNS állománya a VT-hoz hasonló indukciót mutatott, mind UV-B, mind pedig FF hatására, illetve ezek hiányában egyaránt. Ez a jelenség arra utalt, hogy a PhrB nem a hRNS állományon keresztül fejti ki hatását a PSII javítási ciklusára illetve a D1 fehérje pótlására. Ezek alapján megvizsgáltuk azt, hogy a PhrB hatása csak a D1 fehérjére szorítkozik-e, vagy netán általánosabb ennél. A 2D natív géles kísérletünk arra világított rá, hogy PhrB hiányában több fehérje mennyisége is lecsökken. Ezek közül a legfigyelemreméltóbbak a CO2 sejten belüli koncentrációjában szerepet játszó SbtA bikarbonát transzporter, a RuBisCO kis alegységét alkotó RsbC és a sejt motilitásáért felelős, valamint feltehetően klorofill molekula kötésére képes PilA1 voltak. Mind az SbtA, mind pedig az RsbC csökkent mennyisége potenciálisan hatással van psbA gének átírására, mivel a Calvin-Benson ciklus csökkent működését vonnák maguk után, ami pedig reaktív oxigénformák képzéséhez vezet és ezek képesek gátolni a D1 transzlációját. A PilA1 a PSII komplex összeszerelésében játszhat szerepet a klorofill kötő képessége által. Hiányában kevesebb klorofill állhat a rendszer rendelkezésére, így kevesebb funkcionális PSII képződése várható.

Item Type: Thesis (PhD)
Creators: Vass István Zoltán
Hungarian title label: A PhrA fotoliáz és szerkezeti homológja a PhrB kriptokróm szerepe a Synechocystis sp. PCC 6803 kettes fotokémiai rendszerének javítási ciklusában
Title of the thesis in foreign language: The PhrA photolyase and its homologue the PhrB cryptochrome play important roles in the efficient PSII repair cycle of Synechocystis sp. PCC6803
Divisions: Doctoral School of Biology
Discipline label: természettudományok > biológiai tudományok
Defence date label: 2014. October 30.
Item ID: 2238
Identification Number: 2782010
doi: https://doi.org/10.14232/phd.2238
Date Deposited: 2014. Jun. 02. 12:22
Last Modified: 2017. Jun. 23. 16:02
Depository no.: B 5770
Supervisor label:
Supervisor Supervisor scientific name label
Dr Kós Péter
Dr Vass Imre
tudományos főmunkatárs, Ph.D., MTA SZBK Növénybiológiai Intézet
intézetigazgató, az MTA doktora, MTA SZBK Növénybiológiai Intézet
Reviewer label:
Reviewer name label Reviewer scientific name label
Dr. Ughy Bettina
Dr. Wodala Barnabás
tudományos munkatárs, Ph.D., MTA SZBK Növénybiológiai Intézet
adjunktus, Ph.D., SZTE TTIK Növénybiológiai Tanszék
President label:
President name label President scientific name label
Dr. Erdei László
egyetemi tanár, az MTA doktora, SZTE TTIK Növénybiológiai Tanszék
Member label:
Member name label Member scientific name label
Dr. Gombos Zoltán
Dr. Gallé Ágnes
tudományos tanácsadó, az MTA doktora, MTA SZBK Növénybiológiai Intézet
adjunktus, Ph.D., SZTE TTIK Növénybiológiai Tanszék
URI: http://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/2238
Defence/Citable status: Defended.

Actions (login required)

View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year