Studies on the sexual development of Aspergillus nidulans

Keisham Kabichandra
Studies on the sexual development of Aspergillus nidulans.
PhD, University of Szeged.
(2019)

[img]
Preview
PDF (disszertáció)
Download (5MB) | Preview
[img]
Preview
PDF (tézis)
Download (433kB) | Preview

Abstract in Hungarian

A B-típusú High Mobility Group box domén proteinek (HMGB) a kromatin fontos, nem hiszton típusú komponensei, melyek képesek nem-specifikus kölcsönhatások révén a DNS-hez kötődni, illetve a kromatin más fehérje alkotórészeivel interakcióba lépni. Hatással vannak a génexpresszióra, szerepet játszanak a károsodott DNS javításában és a rekombinációban. Kutatócsoportunk az A. nidulans fonalas gomba vizsgálata során 3 HMGB fehérjét azonosított, a HmbA-t, HmbB-t és a HmbC-t. A HmbB fehérje funkciójáról már számos adatot nyertünk, de a HmbA és HmbC funkciójáról, valamint a HmbB szexuális életciklusban betöltött szerepéről még nincs információnk. Jelen munka során egyik célkitűzésünk a HmbA, HmbB és HmbC fehérjék szexuális életciklusban betöltött szerepének feltárása hmbA, hmbB és hmbC delécós törzsek vizsgálatán keresztül, valamint annak megválaszolása, hogy a szexuális fejlődés egyik kulcs-szabályozó fehérjéje, a VeA, és a HMGB proteinek között van-e funkcionális interakció. Jelen értekezésben a veA+ és veA1 genetikai háttérrel rendelkező hmbA, hmbB és hmbC delécós törzsek szexuális struktúráinak vizsgálatával kimutattuk, hogy a HmbA, HmbB és HmbC fehérjék az aszkosórák kialakításának és életképességének fontos faktorai. Rámutattunk, hogy a HmbC funkcionális kölcsönhatásban áll a VeA regulátor fehérjével, amely fény által szabályozott módon koordinálja az aszexuális- és szexuális reprodukciót, valamint a toxikus másodlagos metabolitnak, az STC-nek a termelését. Eredményeink alapján a HmbA és a HmbB részt vesz a környezeti stimulusok érzékelésében is és azok jelátviteli folyamataiban és/vagy a válaszreakciók kialakításában. A szexuális életciklust irányító transzkripciós faktorok mRNS analízise során fényt derítettünk arra, hogy a három HMGB protein a vizsgált szexuális folyamatban érintett gének közül 3 kifejeződését gátolja, 13 gén kifejeződését pedig serkenti. Ez utóbbiak között a legjelentősebb a párosodási-típus (MAT) gének regulációja volt. Érdekes módon mindhárom HMGB protein egyformán szükségesnek bizonyult a matA és a matB gének normális szintű kifejeződéséhez. Mivel kicsi a valószínűsége annak, hogy mindhárom HMGB fehérje közvetlenül szabályozza a MAT gének kifejeződését, lehetségesnek tartjuk, hogy a HmbA és/vagy HmbB és/vagy HmbC a MAT gének “upstream” regulátorai, és akár a környezeti- és intracelluláris faktorok jelátvitelében is szerepet játszhatnak, ezáltal szabályozva a MAT gének aktivációját. Mivel a MAT deléciós fenotípus csak a hmbA deléciós törzsben teljesedik ki, valószínűnek tartjuk, hogy a HmbB és HmbC fehérjék kikerülve a MAT géneket, közvetlenül is befolyásolhatnak MAT gének szabályozása alatt álló géneket. A MAT “upstream” és a MAT elkerülő “downstream” regulátor szerep igazolása további kutatást igényel, amely a jövőben fog megvalósulni. A szexuális fejlődés és a karcinogén hatású másodlagos metabolit, az STC termelése a VeA kulcs-szabályozó fehérje révén kapcsoltak. Számos, gombaevő rovarral végzett kísérlet eredménye alapján úgy gondolják, hogy a gombák által termelt STC a szexuális képletekben akkumulálódik, azonban ezt eddig még senki nem igazolta. Jelen dolgozat második célkitűzése az STC termelés in vivo intracelluláris lokalizációjának vizsgálata volt. A megvalósításhoz egy yCFP riporter rendszert hoztunk létre, ahol az STC bioszintézis génklaszter egy kiválasztott tagjának, az stcO génnek a kifejeződését tudjuk tanulmányozni fluoreszcens mikroszkópban. Mivel egyértelműen szerettük volna a yCFP jelet detektálni, ezért az stcO promóter által vezérelt yCFP-ről keletkezett fehérjét a sejtmagba irányítottuk. Az stcO riporter törzs (egyben stcO deléciós törzs) vizsgálatával igazoltuk, hogy az StcO esszenciális szerepet játszik az STC bioszintézisében és az stcO gén az inkubáció 3. napján történő aktiválódása együtt jár az STC termelésével. Az inkubáció 4. napján nem detektáltunk promóter aktivitást, azonban az STC mennyisége tovább nőtt a 3. napon észlelt STC mennyiséghez képest, amely az StcO fehérje stabilitását fémjelzi és az STC termelés fenntartását. Kimutattuk, hogy az stcO csak azokban a hifákban aktív, amelyek a Hülle sejtek csoportjainak a közelében vannak, valamint azt, hogy a promóter aktivitása fokozatos csökkenést és megszűnést mutat a Hülle sejtektől való távolság növekedésével. Feltételezzük, hogy a szilárd médiumon való STC termelődést egy korai szexuális fejlődési faktor határozza meg, amely helyspecifikusan iniciálja a szexuális fejlődést. Az stcO promóter aktivitás mintázata alapján úgy gondoljuk, hogy az STC termelést támogató faktor(ok)/szignál(ok) egyik vegetatív kompartmentről a másik kompartmentre terjednek egy adott távolságig. Itt megjegyzendő, hogy az stcO promóteraktivitás megszűnik az inkubáció 4. napjára, tehát a 3. napon promóteraktivitást mutató legtávolabbi vegetatív kompartmentek az STC termelés térbeli kiterjedésének a határát jelentik. A távoli hifákban az stcO promóteraktivitás hiánya azt jelzi, hogy a vegetatív micélum morfológiailag egységes, de funkcionálisan különböző hifa sejtekből áll, azaz a distalis vegetatív kompartmentekben nincs STC termelés. Csak további vizsgálatok deríthetnek fényt arra, hogy milyen molekuláris mechanizmus rejlik az STC termelés iniciálás terjedése mögött.

Abstract in foreign language

Beside the linker histones (H1 and H5), the B-type high mobility group box domain proteins (HMGB), as architectural components of the chromatin, participate in various functions of chromatin, such as recombination, repair, inducing or repressing gene expressions. They are able to interact with both DNA and protein components of the chromatin through their high mobility group box (HMG-box) domains. Amongst the fungal HMGB proteins, role of the yeast HMGB proteins was studied in detail, providing vast knowledge on the mode-of-action, molecular- and physiological role of HMGB proteins. However, very few data is known aboult the role of HMGB proteins of filamentous fungi. Detailed study on the function of mitochondrial HMGB protein of P. anserina (mtHMG1) and A. nidulans (HmbB) revealed their role in the maintenance of mitochondrial genome and additionally, nuclear roles were also proposed. Besides the mitochondrial HMGB proteins, four nuclear HMGB proteins were identified in P. anserina and two in A. nidulans (HmbA and HmbC). A recent study on the HMGB proteins of P. anserina revealed that they are involved in the sexual development and fruiting body formation of the fungus. Two of them, PaHMG6 and mtHMG1, also play role in the positive and negative regulation of the expression of the mating-type ranscription factors, respectively. In this work we aimed to study the role of A. nidulans HMGB proteins in the sexual development and found that some of their functions are specific. Through the study of sexual development of control and hmbA, hmbB and hmbC deletion mutants both in veA+ and veA1 genetic background we revealed that HmbA, HmbB and HmbC architectural chromatin components of A. nidulans are required for normal sexual development, especially for the formation and viability of ascospores and the spatial distribution of cleistothecia. Furthermore, we proposed that HmbC functionally interacts with VeA, the key reulator of development and secondary production. We suggested that HmbA and HmbB might be involved in sensing of and responding to the changes of environmental oxygen levels. All HMGB proteins, HmbA, HmbB and HmbC were found to be critical for the normal expression of the mating-type transcription factor genes. We excluded the possibility that all three HMGB linker proteins are required for the direct activation of MAT gene expression. Instead, we propose an alternative explanation for the observed changes: HmbA, HmbB and HmbC might operate on upstream regulator(s) of MAT genes that is (are) most probably involved in the sensing of environmental and/or intracellular factors and/or the transduction of related signals that affect the activation of the MAT genes. Future research should elucidate the potential role of HMGB proteins in the upstream regulation of MAT genes. On the other hand, despite the uniform downregulation of the mating type transcription genes in the hmbA, hmbB and hmbC deletion mutants, we found that only the hmbA deletion phenocopied the mating type gene deletion phenotypes, hmbB and hmbC deletions resulted in various levels of defects in ascospore production and ascospore viability. As an explanation for the various levels of defects observed in hmbB and hmbC deletion mutants we proposed that HmbA, HmbB and HmbC might directly influence the gene expression of various MAT-regulated genes. Additionally, we suppose that hmbA, hmbB and hmbC can provide the functional backups for each other’s loss. Considering all of the phenotypes of the hmbA, hmbB and hmbC strains, and the transcriptional changes observed in case of the expression of sexual development involved regulators we supposed that besides the pronounced down-regulation of MAT genes, a qualitatively different perturbation in the expression of other genes might further contribute to the hmbA-, hmbB- and hmbC-specific phenotypes. Some of the physiological functions of HMGB proteins we revealed are specific for A. nidulans compared to yeast and P. anserina. This includes that HmbA and HmbB play a role in sensing of and/or response to environmental signals. By revealing the functional connections of HmbA and HmbB with signal transduction pathways, one would gain a deeper understanding of the regulatory machinery that governs physiological responses to environmental changes. On the other hand, we found that HmbC functionally interacts with VeA, a key regulator of the coordination of asexual and sexual development, as well as of secondary metabolism. By revealing the functional interactions of HmbC, one would gain a deeper insight into the regulation of these biological processes. Finally, HmbA, HmbB and HmbC are equally important in the positive regulation of mating-type genes, and thereby have a great impact on ascospore production in A. nidulans. The knowledge on the regulation of fungal mating-type genes is scarce, thereby clarifying, whether these HMGB proteins influence the mating-type gene expression directly or indirectly (e.g. via the modulation of upstream regulatory factors) would be of great interest. Additionally, future works should elucidate the gene-expression modulatory role of the HMGB proteins on a genome-scale that might lead to a more detailed characterization of the physiological roles of HmbA, HmbB and HmbC. Sexual development is coupled with the production of the toxic secondary metabolite, STC at regulatory level. Studies focusing on the sexual development revealed that many regulatory loss-of-function mutants fail to produce STC, which ultimately connects these two biological processes through sharing common regulators such as the master regulator LaeA and VeA. Additionally, studies on grazing behaviour of fungivore arthropodes revealed that they sense STC and avoid its consumption. Since the fungivore arthropodes do not graze on sexual structures, it was thought that STC production is linked with sexual structures. In order to provide experimental evidence for this latter hypothesis, we visualized the intra-colonial localization of STC producing hyphae by the development and application of a reporter system using the promoter of one of the putative biosynthetic gene, stcO, fused with the gene of the cyan fluorescent protein (ycfp). Chosing the stcO gene for the reporter system endowed us to unravel the role of StcO in the STC biosynthesis. Since the stcO ORF was replaced by the ycfp gene, the reporter strain could be regarded as a deletion mutant. Measuring the STC content of the reporter strain we proved that StcO plays an essential role in STC biosynthesis. The growth properties and sexual competence of the stcO deletion strain does not differ from those of wild type controls. Microscopy of the stcO reporter strain revealed that the stcO promoter activity begins at the third day of incubation and ceases to zero for the fourth day of incubation. Start of the STC production and start of the stcO promoter activity coincide. Additionally we revealed that although the promoter activity diminishes for the fourth day of incubation, the STC production keeps on going. This might be due to the long life-span and stability of the StcO protein. We showed that STC is produced only on those vegetative hyphal compartments, which are in the close proximity of groups of Hülle cells. Most probably the stcO promoter activation was originated from the center of sexual differentiation. We propose that on solid medium STC production is defined by (an) early sexual developmental factor(s) that locally initiates sexual development. Moreover, according to the observed pattern of the stcO promoter activity, the promoting factors(s)/signal(s) of STC production can be subsequently transmitted to the vegetative hyphae located close to the core of sexual development. The lack of activity in distant hyphae indicates that the vegetative mycelium might consist of morphologically uniform, but functionally different hypha cells. Future works should elucidate the underlying mechanism of signal transmission for STC production from the origin to the nearby vegetative hyphal compartments.

Item Type: Thesis (PhD)
Creators: Keisham Kabichandra
Hungarian title label: Az Aspergillus nidulans sexuális fejlődésének tanulmányozása
Divisions: Doctoral School of Biology
Discipline label: Natural Sciences > Biology
Defence date label: 2019. October 14.
Uncontrolled Keywords: Aspergillus nidulans, high-mobility group proteins, HmbA, HmbB, HmbC, mating type genes, sexual development, sterigmatocystin
Item ID: 10180
Date Deposited: 2019. May. 20. 09:18
Last Modified: 2019. Oct. 28. 08:15
Depository no.: B 6544
URI: http://doktori.bibl.u-szeged.hu/id/eprint/10180
Defence/Citable status: Not Defended. (Do not cite until it has not assigned DOI number!)

Actions (login required)

View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year